响应面法优化超声辅助提取灵芝黄酮工艺研究

陈 芳，温 艳，姜小帆

（1.陕西省食品药品检验研究院，西安 710000；2.陕西省人民医院，西安 710068）

灵芝（Ganoderma lucidum）为多孔菌科真菌灵芝的子实体［1，2］，又名赤芝、红芝、丹芝、瑞草，外形呈伞状，菌盖肾形、半圆形或近圆形［3-5］。在中国普遍分布，欧洲、美洲、非洲、亚洲东部也有不同量产［6-8］。其富含氨基酸、多肽、麦角甾醇、三萜类、黄酮等功能活性成分，从而具有调节中枢神经系统、心血管系统、呼吸系统、抗氧化、延缓衰老等临床药效作用［9-13］。研究发现黄酮化合物是指以2-苯基苯并吡喃酮为母核的一大类天然化合物及其衍生物［14-16］。超声波辅助提取法主要是利用其空化作用破坏植物细胞使提取物溶入提取液中，进而提高了提取效率，是一种操作简单、便捷、能耗低的生物活性物质提取新方法［17，18］。目前，对植物体内黄酮类化合物提取研究报道较多［19-21］。然而，利用响应面法来优化超声辅助提取技术有效地提高灵芝中黄酮提取率的研究还鲜见报道。本试验采用超声辅助法提取灵芝中的黄酮，以提取溶剂乙醇浓度、料液比、浸提功率及浸提时间为考察因素，通过Box-Behnken 响应面设计优化其最优工艺提取条件。筛选出最优提取方法，提高灵芝的综合利用率，降低灵芝黄酮的提取成本，为工业生产技术提供科学理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

灵芝：市售，产地长白山，将灵芝切成碎片后用研磨仪粉碎后备用。

水为GB/T 6682—2008 规定的一级水，由陕西省食品药品检验研究院制备；硝酸铝、乙酸钾、氢氧化钠等（均为分析纯），国药集团化学试剂有限公司；无水乙醇（分析纯），济南润泰化工股份有限公司；芦丁标准品（纯度≥98.0%，生产批号：C100001），北京辉光科技发展股份有限公司。

1.2 仪器与设备

CLN-24L 型低温组织研磨仪、UV-2601 型可见分光光度计，北京红凯瑞利分析仪器有限公司；80目标准试验筛，上海过望化工有限公司；SCQ-1800F型超声波提取仪，上海鸿运仪器股份有限公司；H2500R-2 型高速冷冻离心机，广东祥高实验室仪器有限公司；WB-502S 型超级电热恒温水浴锅，广东环凯生物科技有限公司；OE-45 型电热鼓风干燥箱，天津瑞捷科技有限公司；Research plus 单道移液器，Eppendorf中国有限公司。

1.3 方法

1.3.1 灵芝黄酮的提取 称取灵芝粉末2.0 g（精确至0.001 g）置于150 mL 具塞三角瓶中，用75%～95%的乙醇作为提取溶剂，按料液比1∶（5～25）g/mL 加入提取溶剂，在超声功率为120～200 W 的条件下提取10～50 min，仪器工作频率为40 kHz，提取液以4 500 r/min 离心10 min，取其上清液，按照相同条件继续提取1 次，合并提取液，用旋转蒸馏仪浓缩至1 mL，过C18SPE 小柱进行脱色处理，用无水乙醇定容至50 mL，得到灵芝黄酮的提取液，待测。

1.3.2 芦丁工作曲线的制作 准确称取芦丁标准品50 mg（精确至 0.001 mg）于 50 mL 容量瓶中，加入20 mL 无水乙醇超声溶解后并用无水乙醇定容至刻度，即得1.0 mg/mL 贮备液，放于4 ℃冰箱中储存备用。

精密吸取芦丁贮备液 1、2、3、4、5 mL 分别置于50 mL 容量瓶中，加无水乙醇至总体积为15 mL，依次加入质量浓度为100 g/L 的硝酸铝溶液、98 g/L 的乙酸钾溶液各1 mL；摇匀后加水至刻度，再次摇匀；静置60 min，用1 cm 比色皿于420 nm 处测定吸光度，以30%乙醇溶液为空白；以芦丁浓度为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线，得y=1.457 8x+0.065 78，R2=0.999 8。

1.3.3 灵芝黄酮的测定 精密吸取待测样品溶液1.0 mL，置于50 mL 容量瓶中，按照“1.3.2”进行显色反应后测定，其计算公式为：

式中，X为黄酮类化合物的总含量（%）；m为经标准曲线计算求出样品比色液中的芦丁质量（mg）；W为样品的质量（g）；d为稀释比例。

1.3.4 单因素试验 按照“1.3.1”的方法提取灵芝黄酮，提取条件为固定料液比1∶20（g/mL）、提取功率180 W、提取时间30 min，考察不同乙醇浓度（75%、80%、85%、90%、95%）对灵芝黄酮得率的影响；固定提取溶剂为90%乙醇、提取功率180 W、提取时间30 min，考察不同料液比（1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25 g/mL）对灵芝黄酮得率的影响；固定提取溶剂为90%乙醇、料液比1∶20（g/mL）、提取时间30 min，考察不同提取功率（120、140、160、180、200 W）对灵芝黄酮得率的影响；固定提取溶剂为90%乙醇、料液比1∶20（g/mL）、提取功率180 W，考察不同提取时间（10、20、30、40、50 min）对灵芝黄酮得率的影响。

1.3.5 灵芝黄酮超声波提取工艺的响应面优化 选取浸提溶剂乙醇浓度（A）、料液比（B）、浸提功率（C）、浸提时间（D）为自变量，以灵芝黄酮得率（Y）为响应值，根据Box-Behnken 试验原理做4 因素3 水平曲面设计，应用Design-Expert 8.0.6 软件进行数据分析及模型建立，对超声波辅助提取灵芝黄酮的工艺条件进行优化，试验设计因素水平及编码见表1。

表1 试验设计因素与水平

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

2.1.1 乙醇浓度对灵芝黄酮得率的影响 由图1 可知，当乙醇浓度为75%～90%时，随着乙醇浓度的增加灵芝黄酮的提取得率逐渐增大；当乙醇浓度为90%时，灵芝黄酮的提取得率达到最大值；当乙醇浓度大于90%时，灵芝黄酮的提取得率随着提取溶剂浓度的增加反而逐渐降低。其原因可能是乙醇浓度为90%时，灵芝黄酮的溶出趋于饱和，随着乙醇浓度的增加，其他醇溶性色素、亲脂溶性物质溶出增多，这类物质与黄酮类化合物竞争同乙醇-水分子结合，从而使得灵芝黄酮得率降低。因此选择乙醇浓度为85%、90%、95%进行响应面优化试验。

图1 提取溶剂浓度对灵芝黄酮得率的影响

2.1.2 料液比对灵芝黄酮得率的影响 由图2 可知，当料液比为 1∶（5～20）g/mL 时，随着提取溶剂的增加灵芝黄酮的提取率急剧增加，其原因可能是随着提取溶剂的增加，增大了灵芝样品与提取溶剂的接触面积，有利于灵芝黄酮的溶出，故黄酮提取得率急剧增加；随着提取溶剂的继续增加灵芝黄酮的提取率趋于平缓增长，其原因可能是灵芝黄酮的溶出逐渐趋于平稳，且大部分已溶入提取溶剂中，继续增加提取溶剂会造成其他杂质的溶出，而且还会造成提取成本的上升。因此选择料液比1∶15、1∶20、1∶25（g/mL）进行响应面优化试验。

图2 料液比对灵芝黄酮得率的影响

2.1.3 提取功率对灵芝黄酮得率的影响 由图3 可知，当超声波提取功率小于180 W 时，随着提取功率增大灵芝黄酮的提取得率逐渐增大；当提取功率为180 W 时，灵芝黄酮提取得率达到最大值；当提取功率大于180 W 时，灵芝黄酮的提取得率逐渐下降，其原因可能是超声功率达到一定强度可以产生更好的空化效果，但功率过大可能会破坏黄酮的结构。因此提取功率选择160、180、200 W 进行响应面优化试验。

图3 提取功率对灵芝黄酮得率的影响

2.1.4 提取时间对灵芝黄酮得率的影响 由图4 可知，当提取时间为10～30 min 时，灵芝黄酮的提取得率随着提取时间的延长而上升；并在提取时间为30 min 时灵芝黄酮提取得率达到最大值；当提取时间超过30 min 时，继续增加提取时间，灵芝黄酮的提取得率随着提取时间增加而降低。其原因可能是提取时间为30 min 时，灵芝黄酮已基本完全溶出，继续增加提取时间反而会使其他物质溶出。同时，样品处于长时间的超声中，会导致黄酮结构被分解，造成黄酮提取得率降低。因此选择提取时间为20、30、40 min 进行响应面优化试验。

图4 提取时间对灵芝黄酮得率的影响

2.2 响应面法分析

2.2.1 响应面试验设计及结果 根据Box-Behnken试验原理［22-24］，以提取溶剂乙醇浓度（A）、料液比（B）、浸提功率（C）和浸提时间（D）4 个因素为自变量，以灵芝黄酮得率（Y）为响应值，采用Design-Expert 8.0.6 软件进行4 因素3 水平的响应面分析，试验方案及结果见表2。对表2 中数据进行回归拟合，得到四元二次回归方程：Y=68.78+0.25A+0.39B-0.65C-0.21D+0.55AB-0.75AC-0.49AD-0.64BC-0.65BD+0.45CD-0.35A2+1.35B2-0.16C2-1.57D2。

表2 Box-Behnken 试验设计及响应值

2.2.2 方差分析 由表3 方差分析可知，P模型＜0.000 1，表明回归模型具有高度显著性；P失拟值=0.915＞0.05，失拟值不显著说明模型构建成功，表明试验以外的其他因素对本试验黄酮提取得率影响较小；通过判定系数（R2=0.985）可评价回归模型的拟合程度，其值越接近1，表明回归方程的拟合度越好［25］。根据F的大小可知4 个试验因素对黄酮得率影响的主次顺序依次为提取溶剂乙醇浓度（A）＞浸提功率（C）＞浸提时间（D）＞料液比（B）。其中一次项A、C对黄酮得率的影响极显著；一次项D和交互项AB、AC对黄酮得率的影响显著，其余项对指标影响不显著。

2.2.3 响应面交互作用分析 由图5 可知，乙醇浓度与提取功率对黄酮的得率影响较大，提取时间、料液比次之，表3 的分析结果也与之吻合；乙醇浓度和料液比、乙醇浓度和提取功率两者交互作用显著，表现为响应曲面走势陡峭。

图5 各因素交互作用对灵芝黄酮得率的影响

表3 回归模型的方差分析

2.2.4 最佳提取工艺条件的预测与验证 应用Design-Expert 8.0.6 软件求解二次回归方程可得灵芝黄酮提取最优工艺参数为乙醇浓度86.68%、料液比1∶19.56（g/mL）、提取功率186.82 W、提取时间30.35 min，预测灵芝黄酮的提取得率为7.62%。考虑到黄酮实际提取工作中操作的可行性将工艺参数修正为乙醇浓度86%、料液比1∶20（g/mL）、提取功率185 W、提取时间30 min。在此条件下对所建方法进行验证试验，灵芝黄酮的实际提取得率为7.55%，其与预测值7.62%误差小于3%，因此证实了应用Design-Expert 8.0.6 软件得到的黄酮提取工艺参数真实可靠，具有实际应用价值。

3 小结与讨论

灵芝作为一味珍贵的中药材，具有广泛的药理作用。灵芝中富含氨基酸、真菌溶菌酶、麦角甾醇、三萜类化合物、黄酮等功能活性成分。氨基酸是含有碱性氨基和酸性羧基的有机化合物，陈体强等［26］曾研究报道野生灵芝与栽培灵芝中人体必需氨基酸组分与其含量，研究表明野生灵芝的必需氨基酸组成比例相对栽培灵芝更接近人体的必需氨基酸组成比例，又进一步从紫芝子实体中检出18 种氨基酸，总量为6.07%～6.38%。灵芝多糖的潜在价值巨大，国内外学者利用核磁共振成像技术、高效液相色谱技术、高效阴离子交换色谱与脉冲安培检测器联用等新型现代技术对灵芝多糖进行研究，分析发现灵芝多糖具有抗氧化性、消炎、抑制肿瘤细胞活性和免疫调节等药理活性［27，28］。灵芝三萜化合物种类多、化学结构复杂，主要是由异戊二烯单位构成的羊毛甾烷型，从灵芝中分离三萜类化合物目前有300 多种，按照碳原子数目可分为C24、C27和C30三大类；按照官能团与侧链的不同，可分为灵芝醛类、灵芝醇类、灵芝酸类和灵芝内酯类等；灵芝三萜化合物在临床上具有抗病毒、降血脂、保肝护肝和抗肿瘤等多种药理功效［29，30］。黄酮化合物是指以 2-苯基苯并吡喃酮为母核的一大类天然化合物及其衍生物。研究表明，黄酮类化合物具有抗炎、镇痛、抗肿瘤、抗病毒、防止人体动脉硬化、延缓衰老等功效［31，32］。灵芝各种功能活性成分已被广泛应用于药品、食品、化妆品等领域，对灵芝中各种功能活性成分进行提取可开发成多种类型的功能食品及其他高附加值产品，有助于实现灵芝资源的高值化利用。

本试验采用灵芝为原料，用超声辅助法提取其黄酮，并应用响应面分析法对提取溶剂乙醇浓度、料液比、提取功率、提取时间等因素进行优化，得到的最优工艺参数为乙醇浓度86%、料液比1∶20（g/mL）、提取功率185 W、提取时间30 min。在此条件下对所建方法进行验证试验，灵芝黄酮的实际提取得率为7.55%，其与预测值7.62%误差小于3%，因此证实了应用Design-Expert 8.0.6 软件得到的黄酮提取工艺参数真实可靠，具有实际应用价值。