应用D-L抗体检测辅助诊断阵发性冷性血红蛋白尿症1例

王莉 王立新 秦莉

阵发性冷性血红蛋白尿症（paroxysmal cold hemoglobinuria，PCH）是自身免疫性溶血性贫血中最为罕见的一种，发病率仅为1/100万～10/100万[1-2]。DONATH和LANDSTEINER在1904年证明了该疾病由D-L抗体（Donath-Landsteiner antibodies）引起[3]。由于临床工作中PCH十分罕见，大部分检验科及输血科工作人员对其诊断以及D-L抗体的检测并不熟悉。本文将介绍1例PCH患者的诊断过程以及如何应用D-L抗体检测辅助诊断成人PCH。

资料与方法

1 一般资料 患者鲁某某，男，65岁，因“反复发作性尿色加深2月余”于2021年3月8日至我院血液内科门诊就诊。自述从两个月前开始出现反复尿色加深，呈咖啡色，且可能与低气温有关。两个月前于外院检测血红蛋白77 g/L、直接胆红素48 μmol/L、间接胆红素43 μmol/L，并伴有乳酸脱氢酶明显升高。3月8日于本院检测血红蛋白120 g/L、直接胆红素2.7 μmol/L、间接胆红素7.1 μmol/L、乳酸脱氢酶365 U/L；尿隐血阳性、触珠蛋白＜58.30 mg/L、网织红细胞计数0.1218×109/L；冷球蛋白阴性、6-磷酸葡萄糖脱氢酶（G6PD）3807 U/L，且热溶血、酸溶血、蔗糖溶血以及Rous试验均阴性。由于怀疑患者体内存在D-L抗体引起PCH，于2021年3月18日进行D-L抗体检测试验。

2 试剂与仪器 采集新鲜AB型正常人血清作为补体来源。直接抗球蛋白分型检测卡（西班牙戴安娜，批号：15002.21），低离子溶液（美国 BIO-RAD），卡式离心机（美国 BIO-RAD），试管离心机（日本日立），37 ℃恒温水浴箱（上海一恒仪器）。

3 方法

3.1 标本准备：采集患者及同ABO血型的正常人新鲜EDTA抗凝标本及促凝标本各1管，将促凝管标本分离血清后立即置于37 ℃水浴箱保温，将抗凝管标本分离压积红细胞后以0.9% NaCl溶液洗涤3次备用。采集AB型正常人新鲜血清作为补体来源。

3.2 直接抗球蛋白试验（direct antiglobulin test，DAT）：将洗涤后的患者压积红细胞以低离子溶液配置成0.8%～1.0%红细胞悬液，加入直接抗球蛋白分型卡后离心并观察结果。

3.3 D-L抗体检测：参考美国血液与生物治疗促进协会（Association for the Advancement of Blood & Biotherapies，AABB）技术手册第19版中的冷热溶血试验方法进行D-L抗体检测[4]，具体操作步骤见表1。首先使用患者红细胞进行第一次试验（实验1），随后使用正常人红细胞进行第二次试验（实验2），两次试验的方法步骤完全一致。

表1 D-L抗体检测步骤

结果

1 DAT分型结果 患者DAT呈抗IgG阴性，抗C3d阳性。

2 D-L抗体检测结果 如表2所示，患者血清可使其自身以及正常人红细胞发生溶血，即D-L抗体检测结果阳性。

表2 D-L抗体检测结果

讨论

本例患者出现反复发作性尿色加深，结合其实验室检查结果可初步判断为免疫性溶血性贫血。然而，进一步诊疗却无法确定患者出现溶血的原因。冷球蛋白检测阴性且患者红细胞并未凝集，可排除冷凝集素病；G6PD水平正常，可排除G6PD缺乏症；热溶血、酸溶血、蔗糖溶血以及Rous试验均阴性，可排除阵发性睡眠性血红蛋白尿症。此时我们发现，患者反复发作的尿色加深与低气温有关；当气温回升时，症状有所缓解。因此，我们怀疑患者可能患有由D-L抗体引起的PCH。

PCH多在儿童患者中发现[5-8]，成人相对罕见。与血管内溶血相关的症状和体征是PCH的标志特征，包括暴露在低温后出现深色尿、背部或腿部疼痛、乏力、恶心、呕吐等[9-12]。PCH的诊断需要结合临床和实验室结果，当患者有相应症状且DAT抗C3d阳性、IgG阴性[13]，同时D-L抗体检测阳性时，即可诊断为PCH。D-L抗体与PCH直接相关，是一种经典的双相IgG抗P自身抗体。TIWARI K等人[14]在检测D-L抗体时特别使用表达P1抗原的红细胞，实际是混淆了P1和P抗原。如今的P1抗原为最早由LANDSTEIER所发现并命名的“P抗原”，在2011年由国际输血协会（ISBT）重新命名为P1抗原，归于P1PK血型系统；而P抗原为SANGER在1955年所发现的Tj（a+）表型红细胞上的Tja抗原，随后由ISBT归于Globoside系统[15]。P抗原是一种几乎在所有人（超过99%）红细胞表面都表达的神经酰胺基团多糖[16]，故本文未对其进行特异性检测。

PCH患者通常表现为DAT抗C3d阳性[13]，本文病例也符合该特征。检测结果显示A2管上清液溶血，是由于患者血清中的D-L抗体在正常人新鲜血清中补体的参与下与红细胞发生反应；A1管上清液溶血，是因为患者标本亦为新鲜采集，补体成分保留较完整。B1、B2管上清液溶血，可能是由于补体级联反应的温度条件并不是完全绝对的。我们认为37℃时补体的级联反应最为活跃，但补体成分可能在孵育后的室温操作中随着逐渐复温而发生了后续的级联反应。A3、B3管上清液未溶血是因为正常人血清中不含D-L抗体。

急性PCH溶血通常是短暂且自限的，临床采取的措施有保暖、避免暴露于寒冷环境[13]以及抗补体治疗[17]等。D-L抗体的存在可能会对输血前检测及交叉配血的结果产生影响，造成配血困难。但由于P抗原阴性的血液较难获得，所以一般不对PCH患者进行输血治疗。结合患者血红蛋白水平及下降速率、临床症状和并发症等，当贫血严重时可在温暖环境下输注经专用仪器加温后的红细胞制品，以防自身抗体与输注红细胞结合。本病例就诊时血红蛋白120 g/L，且由于天气转暖已自行缓解症状，故未输血并建议定期复诊。半年内多次随访显示基本情况良好，暂无复发。

D-L抗体的滴度和热幅可提示PCH的类型，如梅毒性PCH的抗体热幅通常小于15 ℃[13，17-19]。今后的研究应在条件允许的情况下对D-L抗体的滴度以及热幅进行检测，以判断PCH的类型。

综上所述，本研究通过参考AABB技术手册成功对D-L抗体进行了检测，验证了该操作的可行性和参考价值。在临床实践中若无法确定免疫性溶血的原因，可结合近期气温变化及患者出现的症状或体征合理怀疑PCH，并利用D-L抗体检测对其进行辅助诊断。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突