一例抗-D、抗-C、抗-G导致的胎儿新生儿溶血病

黄予 王媛 丁权 张瞻，王俊 丁恒

临床上以ABO血型不合引起的胎儿新生儿溶血病（ABO-HDFN）多见，一般临床症状较轻。非ABO-HDFN以Rh血型不合引起的胎儿新生儿溶血病（Rh-HDFN）为主[1]。大量研究表明抗-D抗体是导致Rh-HDFN中最常见的抗体，日常新生儿溶血病检测中多集中于ABO-HDFN和Rh（D）-HDFN相关检测，可能会漏检其他Rh系统不规则抗体导致的HDFN。本案例报道有“抗-D、抗-C、抗-G导致的HDFN”，G抗原是1种独特的Rh抗原，RhD和RhCE 的C等位基因所编码的Ser103是G活性的关键，抗-G是针对Ser103位特异性的抗体[2]，在一患儿标本中同时检出上述三种抗体的病例不多见，但是同样的案例已经有报道[3]。

材料与方法

1 病历资料 患儿母亲，女，37岁，孕5产2，无输血史，A型Rh（D）阴性血，诊断为先兆临产、急性上呼吸道感染、妊娠合并肥胖症。患儿，男，O型Rh（D）阳性血，Hb 97 g/L、总胆红素292.8 μmol/L、游离试验阳性、放散试验阳性、直接抗人球蛋白试验阳性，诊断为Rh（D）血型不合新生儿溶血性贫血、新生儿高胆红素血症、高危儿。向医院输血科申请O型Rh（D）阴性血3 U准备为患儿换血治疗，行交叉配血试验时发现主次侧不合，遂将标本送至我站血型参比室检测。

2 试剂与仪器 日本Kubota公司生产血型免疫离心机KA-2200；恒温水浴箱HH-W21-600；单克隆抗-A，抗-B（20210405）、ABO反定型细胞（20215344）、抗-C（批号：20193002）、抗-c（批号：20213101）、抗-E（批号：20203201）、抗-e（批号：20193301）、谱细胞（20211129）、抗人球蛋白（IgG、C3d）（批号：20205001）、凝聚胺试剂（20217503）、酸放散试剂（20212101）均为上海血液生物医药公司生产；IgG/IgM型抗-D（批号：BMH1906F）为英国Bioscot公司生产。

3 方法 1）对母亲和患儿进行ABO及Rh血型鉴定、直接抗人球实验、不规则抗体鉴定。血型鉴定根据试剂说明书采用试管法进行检测，采用盐水法（NS）和间接抗人球蛋白试验法进行不规则抗体鉴定，并做自身对照试验。2）患儿直抗阳性红细胞采用56℃放散法，对放散液采用盐水法（NS）和间接抗人球蛋白试验法（IAT）进行不规则抗体鉴定。3）吸收放散实验：分别取C+D–和C–D+压积红细胞1 mL，与母亲血清各1 mL按照1∶1混匀，混匀后置37℃孵育1 h，期间定时混匀。吸收完成后离心迅速分离上清和红细胞，用大量温盐水（37℃）洗涤红细胞6次后严格按照试剂说明书采用酸放散法进行放散，采用表型为CCdee和ccDEE的O型细胞对吸收后的上清和放散液进行检测（盐水、IAT法）。4）患儿交叉配血试验采用盐水法、间接抗人球试验法和凝聚胺法。以上试验均按照输血技术操作规程操作[4]。

结果

1 血型 母亲血型为A型，ccdee，患儿血型为O型，CcDee。患儿直抗3+，单抗IgG 3+，单抗C3d 3+。

2 抗体鉴定结果 母亲及患儿抗体鉴定结果均为1、2、3、4、5、6、8、10号谱细胞阳性，对照抗体鉴定谱判断可能为抗-D或抗-D合并抗-C。由于该抗体鉴定细胞无法区分抗-D和抗-C，需进一步做吸收放散试验。

3 采用吸收放散试验进行抗体特异性鉴定 在合格献血者标本中筛选足量表型为C+D-的O细胞和C-D+的O细胞作为吸收细胞，C+D-吸收细胞为O，CCdee和O，Ccdee两种表型细胞混匀，C-D+细胞表型为O，ccDEE，吸收细胞均检测直抗为阴性，经生理盐水三洗后制成压积红细胞。C+D-细胞第一次吸收后上清液分别与O型，CCdee，ccDEE细胞反应阳性，提示抗-C未吸收完全，放散液分别与O型，CCdee，ccDEE细胞反应阳性，证明有抗-G存在。进行二次吸收后，上清液只与O型，ccDEE细胞反应，提示抗-C吸收完全，证明有抗-D存在。C-D+细胞第一次吸收后上清液分别与O型，CCdee，ccDEE细胞反应阳性，提示抗-D未吸收完全，放散液分别与O型，CCdee，ccDEE细胞反应阳性，证明有抗-G存在。第三次吸收后，上清液只与O型，CCdee细胞反应，提示抗-D吸收完全，证明有抗-C存在。

表1 母亲及患儿ABO、Rh血型检测结果

表2 母亲及患儿抗体鉴定反应格局

4 交叉配血试验 检测医院首次配血不合的献血者血样发现该献血者表型为O型，Ccdee（即表4中的血液3），复查交叉配血主次侧均不相合。重新筛选表型为O型，ccdee（即表4中的血液1，血液2）的红细胞3.5 U与患儿进行交叉配血，在盐水、抗人球蛋白、凝聚胺介质均主侧相合，制成洗涤红细胞发放。

表3 产妇吸收放散试验（IAT试管法）

表4 患儿交叉配血试验

5 换血治疗 于12月16日筛选O型，ccdee洗涤红细胞3.5 U，AB浆350 mL为患儿行换血治疗，换血后3 h患儿Hb升高至151 g/L，总胆红素下降至200.4 μmol/L，生命体征平稳，未发生输血不良反应。换血后患儿直抗转为阴性，抗体强度减弱。18日再次申请输注红细胞1 U，输血后Hb稳定在133 g/L，总胆红素下降至112.8 μmol/L。

讨论

该患儿血型为O型，产妇血型为A型，故可排除ABO-HDFN。进一步检测，患儿Rh分型结果为CcDee，产妇Rh分型结果为ccdee，患儿直抗3+，游离试验＞2+。产妇血清，患儿血清及红细胞放散液里均检出IgG抗体，格局一致。产妇血清经C+D-细胞吸收后上清与C-D+细胞反应阳性，证明有抗-D存在；产妇血清与C-D+细胞吸收后上清与C+D-细胞反应阳性，证明有抗-C存在；产妇血清经C+D-细胞吸收后放散液与C+D-、C-D+细胞均反应阳性，证明有抗-G存在。经吸收放散试验检出产妇血清里有抗-D，抗-C，抗-G，可证实患儿为抗-D、抗-C、抗-G导致的Rh-HDFN。

临床上以ABO-HDFN最多见，其次为Rh-HDFN。在不规则抗体阳性孕产妇中，Rh系统血型抗体检出率为56%，明显高于其他血型系统[5]。与Rh-HDFN最密切相关的五种抗原是D、E、C、c、e，国内多项研究显示引起Rh-HDFN的不规则抗体最常见的是抗-D，其次是抗-E，抗-Ec[6-8]。抗-D+C，抗-G较少见，根据上海的报道抗-D+C频率为3.6%[9]，根据厦门的报道抗-D+G频率为1.5%[10]。这与Rh系统抗原免疫原性强弱及人群中Rh表型分布频率有关。Rh血型系统导致的HDFN一般临床症状严重，如果不能及时采取有效的治疗手段，可能会导致严重的不良后果，其中抗-D导致的HDFN可能比其他Rh系统抗体更严重。G抗原存在于携带有C或D的红细胞上，G抗体表现为抗-D加抗-C且两者无法分离[11]，然而这种抗体可以被C+D-或C-D+的红细胞吸收，通过吸收放散试验可以区分抗-D、抗-C和抗-G[12]。抗-G最常产生于表型为ccdee的个体，有研究表明在Rh（D）阴性人群中表型ccdee（57.18%）明显多于Ccdee（30.25%）和CCdee（6.41%）。由于抗-G表现为抗-D+C当血清里表现出抗-D+C的格局时，可以区分成几种抗体组合模式;抗-D+C，抗-D+G，抗-C+G，抗-D+C+G。根据PALFI等人2001年报道的数据，27名初始鉴定为抗-D+C同种免疫的女性通过吸收放散实验最终鉴定出：抗-G+C（14.8%），抗-D+G（25.9%），抗-D+C（11.1%），抗-D+C+G（48.1%）[13]。由于国外预防性使用RhIG，区分血清表现为抗-D+C的女性是否含有抗-G是很重要的，对于只含有抗-G+C而没有抗-D的女性，需要预防性注射RhIG，预防抗-D的产生[13-14]。

本例报道的抗-D+C+G导致的HDFN很容易漏检抗-C和抗-G，在实验室只有一套谱细胞不具备区分抗-D和抗-C的情况下，通过吸收放散试验来区分抗-D和抗-C是较为可行的方法。而抗-G可以与C和（或）D抗原阳性的细胞反应，易被鉴定为抗-D和（或）抗-C，在孕产妇Rh表型为ccdee且抗体鉴定表现为抗-D+C的情况下应该高度怀疑合并有抗-G，需用吸收放散试验来准确区分。G抗原位点在DCe／DCe表型上为9900～12200个，dCe／dCe有8200～9700个，DCE／DCE有5400个，DcE／DcE有3600～5800个，Dce／Dce有4500～5300个，DcE／dce有4200个，抗-G与C抗原反应强度大于D抗原。在进行抗-G鉴定时，应优先选择抗原位点更多红细胞作为吸收细胞，以保证实验效果[15]。本例报道中，用C+D-胞进行吸收时，第二次可完全吸收抗-G和抗-C，用C-D+进行吸收时，第三次才能够完全吸收抗-G和抗-D，赫萧、屠佳燕等人在鉴定抗-G、抗-D的过程中，抗体经过反复吸收才能够吸收完全[16-17]。本试验发现在用C-D+细胞进行第三次吸收后，放散液只与O，ccDEE细胞反应，提示只放散出抗-D，但在C-D+第一次吸收后放散液中已经证实了抗-G的存在。可能是因为随着反复吸收次数的增加，待检测血清会稀释，待检测的抗体有可能会减弱[11]，放散试验能够放散下来的抗体强度也会越弱，而抗-G的效价一般较弱，在第三次吸收前已经被吸收完全。较为遗憾的是，本试验同时存在抗-D和抗-C，无法进一步做抗-G效价测定。

对于产生抗-C和（或）抗-G的Rh（D）阴性受血者，不能单纯地输注Rh（D）阴性血液，本例报道输血科人员误判定为Rh（D）-HDFN，漏检了抗-C和抗-G，仅选择Rh（D）阴性血液是不能配合的。并且该产妇在做产前筛查时并没有进行不规则抗体相关筛查和效价监测，输血科没有提前备好相应血液，加上产后新生儿溶血病检测耗费较长时间导致新生儿等候换血的时间加长。该产妇妊娠5次分娩2次，Rh分型为ccdee，属于具有不良妊娠史的Rh（D）阴性女性，根据2021年中国输血协会免疫血液学专家委员会发布的《胎儿新生儿溶血病实验室检测专家共识》[1]提出，所有孕妇在妊娠8～12周建档时进行ABO和RhD血型鉴定，红细胞不规则抗体筛查。抗体筛查阳性时需鉴定抗体特异性，进行抗体效价检测；抗体筛查阴性时，28周复查。根据李志强、李翠莹等人发表的文章[18-19]指出，须对RhD血型确认试验（血清学方法）结果为阴性的孕妇的胎儿（新生儿）生父做ABO 血型（正反定型）与RhD血型（初筛）鉴定，以及其他Rh表型（ C、c、E、e）检测；须对RhD血型确认试验（血清学方法）结果为阴性的孕妇做不规则抗体筛查结果再次确认，如果筛查结果阳性，应做抗体鉴定并测定抗体效价。

该患儿经换血治疗后抗体减弱，经换血和输血后好转出院。本病例提醒我们对于多次妊娠和（或）Rh（D）阴性的孕妇，产前做好不规则抗体筛查和效价监测是必要的。以及在使用谱细胞鉴定抗-D时需要谨防抗-C和（或）抗-G的漏检，必要时可进一步利用吸收放散试验进行区分。

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