茶叶浸取液制备的纳米银对土壤微生物的影响

洪慈清，孙语遥，莫雯婧，方 云，陈芳容，桂芳泽，关 雄，潘晓鸿

（福建农林大学闽台作物有害生物生态防控国家重点实验室&生物农药与化学生物学教育部重点实验室&海峡两岸特色作物安全生产省部共建协同创新中心，福州 350002）

0 引言

纳米银是一种粒径处于纳米(1×10-9m)级别上的超精细单质银粒子，因其尺寸小、比表面积效应大及宏观量子隧道效应等[1]，在医学、催化、水处理、电子工业等领域被广泛应用[2]。有学者研究发现添加了纳米银的医用抗菌敷料能够对烧伤患者起到良好的抗菌疗效[3]；利用纳米银修饰的电极活性位点较为丰富，可用于提高电极的灵敏度[4]；LIN等[5]通过试验证明复合海藻酸的银纳米材料具有良好的消毒性能；VAN[6]等制备氧化石墨烯/银纳米抗菌复合材料，并发现其对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抗菌效果显著，最小抑菌浓度为0.16 μg/mL。当前，物理手段、化学手段以及生物手段均可用于制备纳米银，而生物手段主要分为微生物还原法和植物还原法共2种[7]。相较于其他方法，植物还原法对设备技术要求不高、对人体危害较小，且其来源丰富，产生的代谢物较少[8]，因此，利用植物还原法制备纳米银，该过程绿色环保、价格低廉、社会经济效益较高。如今已发表的研究论述了柿果皮、酸枣叶、苦艾、银杏叶等植物及其提取物用于制备纳米银的方法，例如，ALI等[9]通过探究得到，若用苦艾为原料制备尺寸较小、稳定性好且产率高的纳米银，其最佳比例为6体积苦艾提取物(10 mg/mL)与4体积硝酸银溶液(2 mmol/L)混合，说明植物还原法能够有效制备纳米银。

随着纳米材料的广泛应用，直接或间接导致了一些医学和环境上的问题，如在使用过程中发生风化、磨损、老化等现象，导致纳米材料释放到环境中[10]，从而给环境带来隐患，对生物体和人类产生潜在的威胁，故纳米材料的生物安全性问题得到了学者的大量关注。石墨烯纳米材料虽然被证明生物相容性很好[11]，但MA等[12]研究发现，若石墨烯的尺寸较小则更易于进入细胞内部，而尺寸较大的石墨烯更易于导致炎症反应的发生，且均具有一定的细胞毒性。当前对纳米银的危险评价也引起了广泛关注，何伟等[13]总结了纳米银对呼吸道有一定的危害，易损伤肺泡甚至是心脏、肝脏等人体器官，但罗斌等[14]研究发现对重度烧伤患者采用外敷纳米银敷料，能够在无明显毒副作用的情况下，较好地促进了创面的愈合并抑制炎性反应的发生，与其他学者研究结论一致[3]；蔡鸣等[15]也通过研究表明纳米银敷料的药物能有效缩短疮口愈合时间且安全性好。

鉴于当前将纳米材料作为抗菌剂的潜力，应该对其安全性进行深入评估，而目前纳米银对土壤微生物影响的报道不够系统。因此，本研究利用茶叶浸取液通过植物还原法制备纳米银，并将其制成1000 mg/L的纳米银喷雾，设置对照试验，探究纳米银对土壤微生物多样性和群落结构的影响，以验证茶叶浸取液制备的纳米银的安全性，拓宽纳米银材料的潜在应用范围，以期为纳米材料在环境及医疗等领域的深入应用提供一定的理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

土壤取自福建农林大学南区后山茶园。铁锹；10目筛网；经过高压蒸汽灭菌、锡箔纸包裹的1000 mL烧杯；托盘；100 mL喷雾瓶；冰袋；一次性手套；75%酒精（国药公司）。

纳米银为前期实验室利用茶叶浸取液还原AgNO3溶液制备得到的15.41 nm的小颗粒纳米材料，其对茶拟盘多毛孢和大肠杆菌的生物活性良好[16]。

试验在福建农林大学生物农药与化学生物学教育部重点实验室，于2021年4—6月进行。

1.2 纳米银对土壤微生物的影响

1.2.1 土壤样本取样 于福建农林大学南区后山茶园中，选择海拔较高、人为干扰小的一块1 m×1 m的正方形土地作为采样样方。将覆盖在土壤上的杂物除去，用携带的酒精对铁锹进行擦拭。采用五点取样法，除去表层约2 cm的土壤而挖取深约2～10 cm处的土壤。将所得土壤放入前期高压灭菌后的烧杯中，用锡箔纸重新包裹后带回实验室。

用已消毒过的10目筛网过筛，去除样本中的植物、可见动物以及石粒等。

1.2.2 土壤样本对照处理 将过筛后的土壤平均分成2部分，分别平铺在高压灭菌后的托盘里。实验组喷洒1000 mg/L茶叶浸取液制备的纳米银溶液，对照组喷洒等量的蒸馏水，一天3次，培养3天。将托盘置于通风处，尽量保持土壤微生物原有的生长条件。

1.2.3 土壤DNA的提取 采用五点取样法对培养后的土壤样品分别进行取样，实验组与对照组均取约10 g，将所得样品分别装进不同的密封袋，标清样品名称：对照组为CK，实验组为Nano-Ag，干冰保存送样至上海美吉生物医药科技有限公司进行测序。对土壤微生物中细菌16S选择338F_806R区域进行扩增，通用引物采用带有条码的338F和806R（表1），每个样本的PCR反应进行3次扩增，反应体系和反应条件分别见表2和表3。

表1 通用引物信息

表2 PCR扩增反应体系

表3 PCR扩增条件

试验采用TransGen AP221-02:TransStart Fastpfu DNA Polymerase，共20 μL反应体系（PCR仪型号为ABI GeneAmp® 9700）。

经PCR扩增后，从中取出3 μL的产物进行2%琼脂糖凝胶电泳，检测其目的片段。

1.3 数据统计与分析

使用微生物多样性云平台对实验所得数据的统计和分析。

1.3.1 物种注释及分类学分析 以silva数据库为对比，采用贝叶斯算法(RDP classifier)对OTU序列（相似水平＞97%）进行分类学统计，并在Domain（域）、kingdom（界）、Phylum（门）、Class（纲）、Order（目）、Family（科）、Genus（属）、Species（种）8个分类学水平上，分析空白对照组与实验组的群落物种组成。等级丰度曲线的横坐标代表的是OTU数目排序等级，等级丰度曲线的纵坐标代表的是OTU水平下的物种数目相对百分含量。如果等级丰度曲线以平滑的趋势下降，则能够说明样本的物种多样性较高，而以极快的趋势下降，则说明样本中的物种多样性较低。

1.3.2 物种聚类分析 根据物种注释结果，选取门、纲、属(Phylum，Class，Genus)这3个分类水平，对空白对照组与实验组的物种组成绘制群落物种相对丰度柱形图或饼状图，以能够直观观察和比对各样本在以上3个不同分类水平上的优势菌群和比例差异。根据实验组和对照组样本在科水平上的物种注释结果及相对丰度差异信息，绘制热图并比对哪些菌群在科水平上为优势菌群（含量较高）。

1.3.3 Alpha多样性分析 总共采用5个相关指数来反映空白对照组与实验组的土壤样品中微生物群落的丰富度以及多样性，相关指数主要有覆盖度(Goods_Coverage)、香农指数(Shannon)、辛普森指数(Simpson)、Chao指数和ACE指数，并进行数据的差异性分析。

2 结果与分析

2.1 PCR扩增

提取土壤微生物的DNA并采用带有条码的338F和806R引物进行PCR扩增，PCR产物目的条带大小正确，浓度合适，得到的凝胶电泳图中目的条带单一且清晰（图1，对照组为1，实验组为2），表明DNA提取成功。

图1 PCR扩增结果电泳图

2.2 微生物多样性及群落结构分析

2.2.1 测序饱和度分析 通过对细菌16S中338F_806R的序列进行扩增检测，数据序列优化后一共得到有效序列数110928条，优化碱基数目45860303 bp，平均有效读长为413 bp。细菌16S扩增测序数据饱和度是反映土壤DNA样品物种是否充分的被测到，而稀释曲线则是一个重要的指标，通过评价测序的数据量能够在一定程度上间接体现物种的丰富程度[17]。如测序结果的稀释曲线所示（图2），在横坐标（样品测序数目）不断增大的情况下，可以看出后期OTU数目趋于稳定且曲线是较平缓的趋势，这充分说明样品取样充分合理，而且本次测序的深度能够大体上满足土壤微生物多样性研究的要求。

图2 土壤样品DNA的稀释曲线图

2.2.2 纳米银对土壤微生物多样性的影响 对物种进行注释有助于深入分析其多样性，故在OUT水平上进行分类学统计得到分类单元(Taxon)个数为：Domain：1，Kingdom：1，Phylum：25，Class：60，Order：138，Family：218，Genus：357，Species：590，OUT：1041。由 Rank-Abundance curves曲线（图3）得知，随OUT数目的增加，曲线下降速度逐渐趋于平缓，说明样品的物种多样性较高。

图3 等级丰度曲线

采用Alpha多样性作为指标对土壤微生物丰富度和均匀度进行综合评价[18]。通过比较土壤样本空白对照组、实验组的Alpha多样性，主要分析群落多样性（香农Simpson指数和辛普森Shannon指数）以及群落丰富度（Chao指数和ACE指数）两方面，可以反映出茶叶浸取液制备的纳米银对土壤微生物造成的影响（表4）。

表4 多样性指数表

覆盖度(Goods_Coverage)指数反映了对照组和实验组的样本序列被检测出的可能性。而空白对照组与实验组的Coverage数值均大于99.71%，数值较高，样本序列极大可能被检出，能够体现出对照组和实验组中土壤微生物的真实生长情况。

而反映群落多样性的指数（Simpson指数和Shannon指数）说明：空白对照组与实验组在OUT水平上的Shannon指数均大于5.46，而两组在OUT水平上的Simpson指数均小于0.02，且空白对照组与实验组中微生物的Shannon指数和Simpson指数的数值差异较小，这说明茶叶浸取液制备的纳米银并不显著影响土壤中细菌的多样性。参考相关文献得知若Shannon指数数值越高，则群落多样性越高，但Simpson指数则相反[19]。Shannon和Simpson 2种指数得出的结论相互验证，说明了茶叶浸取液制备的纳米银对土壤微生物群落多样性并无显著影响，一定程度上证明了纳米银的安全性。

采用ACE指数和Chao指数作为指标来评价空白对照组与实验组样本的丰富度，从表4数据可知：纳米银的喷洒对ACE和Chao指数的影响均不大，ACE指数差异小于2，Chao指数差异小于6，表明当土壤受到茶叶浸取液制备的纳米银处理后，并不明显影响微生物群落的丰富度，且对细菌群落多样性无显著差异。

2.2.3 纳米银对土壤微生物群落组成的影响 空白对照组与实验组的土壤DNA样本文库在细菌门水平的相对丰度中显示出高度相似性。喷洒了纳米银的实验组与喷洒了蒸馏水的空白对照组的土壤中，所具有的物种类别基本一致，但是不同类别物种的丰度具有一定差异。图4左图所示，样本中主要的细菌门有放线菌门(Actinobacteria)、变形菌门(Proteobacteria)、绿弯菌门(Chloroflexi)、厚 壁 菌 门 (Firmicutes)、酸 杆 菌 门(Acidobacteria)、芽单胞菌门(Gemmatimonadetes)、粘菌门(Myxomycota)和浮霉菌门(Planctomycetes)，而不能被分类到任何组的序列被归类为其他(others)。从图中可以看出优势菌门为放线菌门，在实验组和对照组的样本中占比均超过40%，其次为变形菌门、绿弯菌门、厚壁菌门、酸杆菌门、芽单胞菌门、粘菌门和浮霉菌门，相对丰度分别达到20.72%～30.64%、7.27%～17.45%、5.84%～7.07%、5.04%～7.41%、1.74%～2.34%、1.03%～1.23%、0.62%～1.13%。而CK空白对照组与实验组丰度存在较大差异的是变形菌门和绿弯菌门，说明茶叶浸取液制备的纳米银的处理对变形菌门的部分菌群产生抑制作用，而对绿弯菌门的部分菌群生长产生一定的促进作用。

图4右图显示，在纲水平上优势细菌纲（相对丰度＞3%）主要有放线菌纲(Actinobacteria)、α-变形菌纲(Alphaproteobacteria)、嗜热油菌纲(Thermoleophilia)、纤线杆菌纲(Ktedonobacteria)、芽孢杆菌纲(Bacilli)、酸微 菌 纲 (Acidimicrobiia)、γ- 变 形 杆 菌(Gammaproteobacteria)，它们的相对丰度分别为26.11%～27.34%、18.44%～26.25%、11.56%～15.52%、3.23%～11.64%、5.05%～5.90%、3.80%～5.32%、2.29%～4.39%。其中，茶叶浸取液制备的纳米银对α-变形菌纲、嗜热油菌纲和纤线杆菌纲的影响较大，对α-变形菌纲和嗜热油菌纲产生抑制生长作用且促进纤线杆菌纲的生长。

图4 不同样本中细菌门和纲水平的相对丰度（左为门水平，右为纲水平）

通过空白对照组与实验组的土壤样品之间的细菌属的丰度占比汇总（图5，相对丰度＞1%均已在图中注明），样本中主要的细菌属（相对丰度＞2%）有3种，还有未分类细菌(unclassified bacteria)、未明确细菌(norank bacteria)及其他(Others)，占比超过60%。在3种已分类的菌属中，热酸菌属(Acidothermus)最有优势，相对丰度达到11.82%～15.52%，其次是链霉菌属(Streptomyces)和杆菌(Bacillus)，占比为2.61%～2.77%、1.93%～2.59%。

图5 不同样本中细菌属水平的相对丰度（左为CK，右为Nano-Ag）

绘制科水平上的热图（图6），其中较为优势的科有热酸菌科(Acidothermaceae)、黄色杆菌科(Xanthobacteraceae)等，在进行茶叶浸取液制备的纳米银处理后，对热酸菌科和黄色杆菌科的影响较为明显（前者表现为促进效果，后者表现为抑制作用），但实验组和对照组之间2个科的相对丰度差异均小于6%，不能够说明喷洒茶叶浸取液制备的纳米银对土壤微生物细菌科有显著影响。

图6 群落热图呈现科水平下（相对丰度排名前30位）不同样本之间的差异

3 结论与讨论

本课题组前期工作探讨了纳米银的制备过程[16]，以茶叶浸取液为原料，用植物还原法制备的纳米银为小颗粒状形貌，对茶拟盘多毛孢和大肠杆菌的抑菌率可达96.05%和61.87%。对比其他方法制备纳米银[20-22]，用该法制备纳米银抗菌材料，原料来源简单，价格低廉，绿色环保，具有社会经济效益高的特点。本研究将制得的纳米银抗菌材料制成纳米银喷雾，并设置对照试验，结合数据手段探究喷洒纳米银对土壤微生物多样性和群落结构的影响。通过对细菌16S中338F_806R的序列进行扩增检测，数据序列优化后一共得到有效序列数110928条，优化碱基数目45860303 bp，平均有效读长为413 bp。通过后续数据分析结果表明：在土壤微生物多样性方面，喷洒纳米银后，空白对照组与实验组的Coverage数值均大于99.71%，能够体现出对照组和实验组中土壤微生物的真实生长情况；空白对照组与实验组在OUT水平上的Shannon指数均大于5.46，而两组在OUT水平上的Simpson指数均小于0.02，且空白对照组与实验组中微生物的Shannon指数和Simpson指数的数值较为接近，2种指数得出的结论相互验证，说明了喷洒茶叶浸取液制备的纳米银并不显著影响土壤微生物群落多样性，一定程度上证明了纳米银的安全性；而ACE指数差异小于2，Chao指数差异小于6，这些结果表明当土壤受到喷洒茶叶浸取液制备的纳米银处理后，并不明显影响微生物群落的丰富度，且对细菌群落多样性无显著差异。

在土壤微生物群落结构方面，空白对照组与实验组的土壤中，所具有的物种类别基本一致，但是不同类别物种的丰度具有一定差异。从门水平来说，喷洒茶叶浸取液制备的纳米银的处理对变形菌门产生抑制生长作用，而对绿弯菌门产生一定的促进作用；从纲水平来说，纳米银对α-变形菌纲和嗜热油菌纲产生抑制作用而促进纤线杆菌纲的生长；从相对丰度排名前30位的细菌科水平上看，相对丰度变化较大的有热酸菌科和黄色杆菌科，但相对丰度差异均小于6%，不能够说明喷洒纳米银对土壤微生物细菌科有显著影响，并且对土壤微生物而言具有一定程度的生物安全性。

据报道，纳米银-氧化淀粉涂膜对果实去皮后纳米银迁移率仅为1%～9%，其累积量远低于欧盟限量标准，说明纳米银复合材料对去皮果实并无较大的毒害作用[23]；陈江魁[24]对小鼠经口灌喂5000 mg/kg纳米银后小鼠安全，表明纳米银并未诱变小鼠骨髓PCE，有一定的生物安全性；纳米银复合活性炭纤维布无菌止血敷料对烧伤创面的愈合有良好的促进作用且安全性较好[25]。本研究结论与前人研究较为相似，均证明了纳米银抗菌材料具有一定程度的生物安全性，展现了纳米银材料良好的应用前景。

本研究通过实验和数据分析，探究了喷洒茶叶浸取液制备的纳米银对土壤微生物多样性和群落结构的影响。从多样性指数表（表4）可知，空白对照组与实验组的Shannon指数、Simpson指数、Chao指数、ACE指数和Goods_Coverage指数的数值差异并不显著；从群落结构分析图（图4～6）可知，在门、纲、科、属水平上，实验组的结果均与对照组无显著差异。该结果在一定程度上验证了喷洒茶叶浸取液制备的纳米银的生物安全性，为纳米银作为抗菌材料提供了理论依据，为今后纳米材料在环境、医疗等方面的深入研究奠定基础。