青海省西宁地区绵羊住肉孢子虫感染情况调查研究

孟 茹，付 永，王淑琴，康 明，张成图，吴 英，陈永忠，谢彩英

（1西宁市动物疫病预防控制中心，西宁 810003；2青海畜牧兽医科学院，西宁 810003；3青海大学农牧学院，西宁 810000）

0 引言

住肉孢子虫(Sarcocystis)是一种人畜共患的传染病[1-2]，属于顶复门，孢子虫纲，真球虫目，住肉孢子虫科，住肉孢子虫属，是专性寄生于细胞内的原虫[3]。住肉孢子虫中间宿主多为食草动物，终末宿主多为食肉动物，羊是其重要的中间宿主[4]。绵羊住肉孢子虫病在世界分布广泛[5]，寄生于绵羊的住肉孢子虫有4种，分 别 为 S.gigantea、 S.medusiformis、 S.tenella、S.arieticanis，前2种终末宿主是猫科动物，后2种终末宿主是犬科动物且均对羊有致病性。中国绵羊住肉孢子虫的平均阳性率为41.5%，最低阳性率为7.74%，而最高阳性率为100%[6]。住肉孢子虫病不仅影响肉品质量，而且严重危害人类的健康[7-8]。西宁市人口占全省人口的1/3，部分地区少数民族人口达到了80%以上[9]，食用肉类主要以牛、羊肉为主。目前，已证实多种住肉孢子虫具有较强的致病性，主要表现在感染后可引起贫血、消瘦、乳产量下降、流产甚至死亡[10-11]，然而西宁地区住肉孢子虫系统的专项流调几乎是空白，因此掌握西宁市及其辖属区县绵羊住肉孢子虫的感染强度并明确感染类型可以为有效开展住肉孢子虫病防控提供科学的技术支撑。

1843年Miescher第1次通过镜检在鼠横纹肌中发现了白色线状的住肉孢子虫包囊[12]，1990年王光雷[13]提出通过观察住肉孢子虫囊壁的形态结构及其在中间宿主体内的发育过程作为羊住肉孢子虫的虫种鉴定指标，住肉孢子虫的研究不断深入。目前，住肉孢子虫的诊断技术除经典的组织压片镜检外，胃蛋白酶消化技术、免疫学检测以及分子生物学检测技术的研究也日益广泛，但在肉品检验中，组织压片镜检耗时长检出率低，胃蛋白酶消化技术又常常会使肌细胞被过度消化，影响观察，容易出现漏诊[14]。分子生物学鉴定是目前确定感染虫种最可靠的方法，常用的候选基因有18SrRNA、28SrRNA和线粒体细胞色素C氧化酶亚基I(cytochrome C oxidase subunit 1,Cox1)基因[15]。其中Cox1基因是线粒体基因组中比较保守基因，具有中度的变异速率，广泛用于细胞和寄生虫种属鉴别及交叉污染分析[16]，多项研究表明其适宜于种间的分类鉴别和系统发育，近年来广泛用于住肉孢子虫分类研究[17]。目前针对西宁市辖属区县市场流通的羊肉各肌肉部位住肉孢子虫感染率、感染强度系统研究还很欠缺，因此，掌握西宁市市场流通中羊肉的住肉孢子虫感染情况，为牛羊肉调运流通的关键地区提出防控住肉孢子虫病的有效措施，为西宁市的牛羊调运及市场流通的牛羊肉检验检疫是否应该加入关于住肉孢子虫病的检测提供科学依据，都是目前西宁市动物疫病防控特别是人畜共患病防控和保障市民购买的畜产品质量安全面临和急需解决的问题。

1 材料与方法

1.1 材料

在西宁市的青海裕泰屠宰场、湟源县的青海众和肉食品有限公司随机抽取供往西宁市辖属区县各市场、超市及摊贩的屠宰后绵羊，分别采取剔除脂肪组织和结缔组织后的膈肌、心肌、舌肌、食道肌样品各40份，每份至少10 g，编号并标明样品来源及日期后装于样品袋中立即带回西宁市动物疫病预防控制中心病理室，-40℃冰箱保存。试验在西宁市动物疫病预防控制中心病理实验室开展，于2018年11月—2019年10月进行。

乙醇溶液（国药集团化学试剂有限公司，生产批号20190403）、4%多聚甲醛通用型组织固定液（Biosharp，生产批号1608145）、二甲苯（莱阳经济技术开发区精细化工厂，生产批号20140518）、染色机（湖北省孝感市亚光医用电子技术有限公司，型号YR-23）、包埋机（湖北省孝感市亚光医用电子技术有限公司，型号YB-6LF）、切片机（湖北省孝感市亚光医用电子技术有限公司，型号YGQ-3128D）、上海华连医疗器械有限公司电热恒温培养箱（型号DHP-9082型）、奥林巴斯显微镜（徕卡显微系统（上海）有限公司，型号CX21）、显微成像系统（奥林巴斯（日本）有限公司，型号Motic BA310）。

1.2 方法

1.2.1 压片镜检 首先剥离肉样表面肌膜、脂肪，肉眼观察肌肉表面是否存在白色米粒状或点状疑似虫体存在。食道肌可直接观察是否存在住肉孢子虫包囊，膈肌、心肌、舌肌剖开表层肌肉顺肌纤维方向剪取肉样1 g，尽量不要剪的很碎，之后再将剪取的肌肉横切剪至米粒大小，每块载玻片放5～6小块，用力将肉样压薄，呈半透明状，以透过肉样依然清晰可见报纸上的六号字为准（见图1）。在10×10倍光学显微镜下检查计数，在任何一个部位发现住肉孢子虫包囊，即被判定为阳性，并计数，统计住肉孢子虫感染率、感染强度，未检出虫体者判定为阴性。

图1 膈肌、舌肌、心肌压片图

1.2.2 切片制作及HE染色 刚取的新鲜组织块经4%多聚甲醛溶液固定，冲洗，经不同浓度乙醇溶液脱水，二甲苯透明。经透蜡后将组织连同熔化的石蜡，一起倒入盛有蒸馏水的容器内，使其立刻凝固成蜡块；调整石蜡切片与刀片的位置和角度进行切片，厚度一般为4～7 μm，切片机摇转速度40 rpm；将切片至37℃恒温箱中烘干，用二甲苯脱蜡后经酒精和蒸馏水冲洗，将切片放入苏木精水溶液中染色，树胶封片。

1.2.3 虫种的分子生物学鉴定 采用DNA提取试剂盒对感染样本肉样进行消化、DNA提取。以Cox1的特异性片段为靶基因设计的引物，引物参照Rubiola S[14]上下游引物分别为F:5，-TGTACATACTTACGGCAGGT-3，R:5，-CCGTAGGTATGGCGATCA-3。进行PCR扩增，反应体系为25 μL，其中模板DNA 2 μL，上、下游引物(100 nmol/μL)各 1 μL，10×PCR Master Mix 2.5 μL，BSA1 μL，灭菌去离子水18.5 μL。PCR反应条件为预变性94℃ 5 min；变性95℃ 60 s，退火60℃ 45 s，延伸72℃ 30 s，40个循环；延伸72℃ 5 min。

2 结果与分析

2.1 西宁地区绵羊各部位肌肉感染情况分析

对随机抽样采取的供往西宁辖属区县的屠宰场、超市、集散中心和农贸市场的40只绵羊对应的食道肌、膈肌、心肌、舌肌住肉孢子虫感染情况进行统计，检查出有33份样品有住肉孢子虫感染，具体每份样品不同部位的感染数统计见表1。对此次样品的整体感染情况进行统计分析，此次整体样品感染率为82.5%，其中膈肌的感染率为75%，心肌的感染率为67.5%，舌肌的感染率为57.5%，平均感染强度7.67，不同部位感染状况详见表2。膈肌、心肌、舌肌住肉孢子虫压片镜检结果见图2～4，可以看出，10倍显微镜下观察，住肉孢子虫虫体一般在为300～455 μm，呈长梭形，分布于肌纤维中，与纤维方向平行，囊壁表面平。从寄生部位上看，膈肌感染率最高(75%)，其次是心肌(67.5%)、舌肌(57.5%)，食道肌未见有感染。

图2 西宁地区绵羊膈肌住肉孢子虫10倍镜压片观察结果

图3 西宁地区绵羊心肌住肉孢子虫10倍镜压片观察结果

图4 西宁地区绵羊舌肌住肉孢子虫10倍镜压片观察结果

表1 西宁地区绵羊不同部位肌肉感染数量统计

表2 西宁地区绵羊不同部位住肉孢子虫感染情况

续表1

2.2 染色切片镜检结果分析

对西宁地区绵羊膈肌、心肌住肉孢子虫切片进行观察，结果见图5、图6，经H.E.染色可见虫体呈蓝紫色，周围肌肉组织呈红色，虫体呈长梭形，分布于肌肉纤维间，虫体囊壁分为两层，原生囊壁与次生囊壁均结构平整无突起皱褶等特殊性结构，初步鉴定为绵羊柔嫩住肉孢子。

图5 西宁地区绵羊膈肌住肉孢子虫染色切片结果

图6 西宁地区绵羊心肌住肉孢子虫染色切片结果

2.3 分子生物学鉴定分析

选取虫体含量高的羊心肌和膈肌样品，采用动物基因组抽提试剂盒提取样品DNA，经COI-PCR法扩增目的基因、琼脂糖凝胶电泳检测及分析后，成功扩增出目的条带，PCR产物送上海生工进行测序，序列长度为905 bp。在GenBank上进行序列比对，Blast测序结果标明其与已公布的羊柔嫩住肉孢子虫的同源性达98%，最终鉴定为绵羊柔嫩住肉孢子(S.tenella)，与形态学鉴定结果一致。

3 讨论

3.1 西宁地区绵羊住肉孢子虫的感染强度分析

调查表明，河南地区绵羊住肉孢子虫的感染率为32.48%[18]，湛江羊感染率为70.68%[19]，西宁地区的感染强度要高于国内其他省份。但是在青海省内，青海泽库县不同乡镇的感染率在90%～100%之间[20]，互助县绵羊住肉孢子虫病感染率为100%[21]，青海化隆县[22]绵羊膈肌中住肉孢子虫的感染率为93.3%，数据显示西宁地区绵羊住肉孢子虫的感染强度较青海省其他州县感染整体偏低，特别是此次研究随机采取的样本中未见绵羊食道肌住肉孢子虫的感染。主要原因有3个方面，首先：可能是由于样本采集面及采集数量有限。其次，与城市郊区生活饮食习惯及卫生条件都较牧区有极大改善。最后，与西宁市近年非常重视养犬管理，相继出台《犬类免疫技术规范》、《宠物诊疗机构诊疗活动技术规范》、《西宁市养犬管理条例》等对犬类管理、免疫及诊疗等都进行了规范化管理，对犬进行建档及定期驱虫，粪便严格进行无害化处理等举措有关。关于不同部位的感染情况，相比苏晓雪等[23]通过随机采样后镜检发现青海共和地区藏羊不同部位感染率由高到低依次为心肌(96.88%)、膈肌(87.50%)、食道肌(22.07%)，本次研究我们采集同一只羊屠宰后膈肌、心肌、舌肌、食道肌进行检测，更能反应不同部位的真实感染情况。

3.2 西宁地区绵羊感染虫种分析

常用于住肉孢子虫虫种鉴定的基因有Cox1基因、18S rRNA和28S rRNA基因[24-26]。研究表明，Cox1作为线粒体基因中的保守基因，在寄生虫的分类鉴定和群体遗传方面，被认为是理想的遗传标记，被广泛应用于包括住肉孢子虫在内的原虫的种类鉴别及系统发育分析[27-28]。并且Cox1为靶基因的COI—PCR法要比以18S rRNA和28S rRNA为靶基因的SSU rRNA-PCR和LSU rRNA-PCR的特异性要好，可有效区分住肉孢子虫与其他寄生虫，适合于动物源性食品中住肉孢子虫的筛查[29]。巨金玲等[30]用pcox1序列构建巨型住肉孢子虫与其他住肉孢子虫的种群遗传关系，谢彩英等[31]通过pcox1的PCR扩增、测序与分析，发现共和县藏羊心肌的住肉孢子虫存在2个种。本研究采用COI—PCR法在绵羊膈肌和心肌中扩增cox1的特异性片段，测序后在GenBank上进行序列比对，同源性与已公布的羊柔嫩住肉孢子虫的达98%，因此可以明确目前西宁地区绵羊感染主要以羊柔嫩住肉孢子虫(Sarcocystis tenella)为主。

3.3 西宁市地区住肉孢子虫病防治策略分析

住肉孢子虫病传播主要由犬、猫等终末宿主引起[32]，通过接触污染的食物或者饮水是人和家畜感染住肉孢子虫病的主要途径，因此加强检验检疫和防治污染是控制此病的有效手段[33]，但是检验检疫主要是在农牧防疫、检疫等有关部门开展，同时由于住肉孢子虫病感染后对人的伤害较包虫病、布鲁氏菌病等人畜共患病较弱，在养殖场户的宣传力度也相对薄弱，公众对其相关知识普及率低，特别是牧区等相对落后地区，农牧民更是知之甚少，因此未来防控应考虑农牧、卫生、执法等部门联防联控，同时加强科普宣传力度，利用新闻媒体、农牧服务平台及公众号等各种渠道，使广大农牧民和市民提高认识，以达群防群控的目的。传统治疗该病主要采用伊维菌素、吡喹酮等，目前尚无针对性的疫苗和特效治疗药物[34]，未来住肉孢子虫的有效防治还需加大科研和推广示范力度，筛选可用于免疫和治疗的候选基因并开展有效药物实验。

4 结论

通过对西宁地区羊住肉孢子虫病感染情况调查发现西宁地区绵羊肉住肉孢子虫感染率为82.5%，平均感染强度7.67，从寄生部位上看，膈肌感染率最高75%，感染率已经远高于中国平均水平，因此相关部门急需引起高度重视，考虑制定专项防治计划，并纳入本地区疫病防控体系中。此外本研究通过对Cox1保守区片段扩增、测序、比对初步明确西宁地区绵羊感染主要以羊柔嫩住肉孢子虫为主，为西宁地区评估羊住肉孢子虫病的危害及采取有效防控措施提供了重要科学依据，并且该方法省时、敏感、特异、准确，可考虑进一步优化和完善用于住肉孢子虫病的分子诊断和流行病学调查。