利用DAMD分子标记构建甜菜品种的分子身份证

张紫若，马佳洁，高秋雨，吴则东,2

（1黑龙江大学现代农业与生态环境学院，哈尔滨 150080；2黑龙江省普通高校甜菜遗传育种重点实验室/黑龙江大学，哈尔滨 150080）

0 引言

甜菜作为制糖原料，在中国栽培时期较短，仅有100多年的历史。中国使用甜菜作为试种糖料作物始于1906年，当时的甜菜种子来源于德国；1909年在阿城县建立了第一座甜菜机制糖厂；1936年是建国前种植最多的一年，种植面积约有2.4万hm2；至建国前夕1949年，甜菜面积也才只有约1.6万hm2。建国后由于党和政府的重视，甜菜生产才得以迅速发展[1]。20世纪80年代全国甜菜总面积已达到53.3余万hm2，65%在东北，19.1%在华北，另有10.4%在西北[2]。但从1999年起，由于糖料市场供大于求，国家开始对糖业方面的政策做出调整，甜菜生产急剧下降，整个甜菜行业进入低谷时期。2005年以来，诸多名企先后加入制糖行业，才为整个行业注入了新的生机。

目前，国内使用的甜菜种子大都依靠进口，偶尔会出现假冒伪劣的品种。所以如何鉴别甜菜品种的真实性显得尤为重要。根据传统的表型形态学鉴定法，不仅耗时长，而且形态学特征受环境影响较大，特征表现不稳定，面对遗传亲缘关系较近的甜菜品种，往往难以鉴别。因此，我们选用更加快速、准确、高效的分子标记技术来鉴别甜菜品种。

分子标记在20世纪80年代就已经开始应用，它是继形态学标记、细胞标记和生化标记技术之后发展起来的一种遗传标记[3]。近几十年以来，已经有SNP[4]、EST[5]、ISSR[6-7]、RFLP[8]、RAPD[9]、AFLP[10]、SRAP[11]和SSR[12-15]等多种分子标记技术被运用于甜菜遗传图谱的构建和遗传多样性分析中。李清等[16]通过6对SSR引物，构建了广东省96份大豆种质的DNA身份证。樊晓静等[17]用SNP位点组成的DNA指纹图谱构建了茶树品种资源身份证。而本次研究则通过DAMD分子标记技术来对甜菜品种进行分子身份证的构建。

DAMD分子标记技术全称为基于聚合酶链式反应的小卫星DNA定向扩增[15]。小卫星是由10～60 bp碱基组成的串联重复序列，含有小卫星的区域通常表现出较高水平的限制性片段长度多态性(RFLP)。由于小卫星的遗传方式遵循孟德尔遗传定律，而且具有较高的特异性，因此，可利用小卫星序列作为引物，用PCR技术扩增到小卫星之间的序列[18]，来区分不同的甜菜品种，构建其指纹图谱及进行遗传多样性分析。胡建斌等[19]利用15种小卫星核心DNA引物对20份不同类型的黄瓜进行扩增，结果与SSR标记的实验结果基本一致。兴旺等[20]选用12个甜菜品种对25条DAMD引物进行扩增，发现DAMD引物扩增效率很高，结果稳定，条带清晰。丁刘慧子等[21]用29条DAMD引物对40个甜菜品种进行PCR扩增，8条引物扩增出的101条带中99条均为多态性条带，结果表明DAMD分子标记技术的优点是多态性高，对于鉴别甜菜品种的真实性有高效快捷的作用。

本研究在前人学者的基础之上，利用DAMD引物扩增效率高、结果稳定、条带清晰的特性，构建甜菜品种的分子身份证。以求快速鉴定甜菜品种的特异性，补充和打破形态学鉴定法区分甜菜品种的短板和局限，为甜菜品种的快速鉴定提供依据，以保护农民以及甜菜育种家的利益不受侵害。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 供试品种 实验中所用到的甜菜品种及来源见表1。

表1 供试品种名称及来源

续表1

1.1.2 DAMD引物 7条DAMD标记引物由上海生工生物工程股份有限公司合成，采用HAP方式纯化，其序列来源于相关文献，序列见表2。

表2 DAMD引物信息

1.2 实验方法

1.2.1 甜菜基因组DNA的提取 本研究所用供试品种均种植于黑龙江大学呼兰校区试验田，待其长出4片真叶后，从各品种中挑选10株健康幼苗混样放入2 mL离心管中，经液氮冷冻后研磨成粉末，然后利用CTAB法[22]提取甜菜基因组DNA，最后用紫外分光光度计检测基因组DNA的浓度和纯度，并稀释至20ng/μL，再放置-20℃冰箱冷冻备用。

1.2.2 甜菜DAMD-PCR扩增反应体系 反应体系为5.0 μL 体 系 ：预 混 液 Mix 2.5 μL，水 1.1 μL，引 物0.4 μL，震荡离心，加入DNA模板1.0 μL，最后用涡旋仪混匀。

1.2.3 甜菜DAMD-PCR扩增反应程序 反应程序设定为Touchdown程序，退火温度先由65℃到56℃，1℃两个循环，最后55℃20个循环。

1.2.4 电泳及染色 使用6%的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离PCR扩增产物，每孔点样1.5 μL。使用50 bp的marker，0.5×TBE作为缓冲液，180 V电压分离90 min。电泳结束后将胶板取下用红色荧光G-red染液染色10 min，再放入紫外凝胶成像仪观察结果并记录。

1.2.5 数据统计 根据记录下的图像结果，统计PCR扩增图谱上在同一迁移率位置上的条带，有带记为1，无带记为0，将数据输入Excel表格，统计结果。再利用Mega程序，得到其指纹图谱并进行聚类分析和遗传多样性分析。

2 结果与分析

2.1 96个甜菜品种的指纹图谱构建

利用7条DAMD引物对96个甜菜品种进行PCR扩增，再将其扩增产物通过电泳检测，即可得到扩增产物的清晰条带图。根据96个品种的0、1数据表格即可构建其数字指纹图谱，进而构建96个供试甜菜品种的分子身份证。

本研究在得到以上成果的基础上又逐次减少引物进行聚类分析，以寻求利用最少引物将96个甜菜品种完全区分开，从而建立分子身份证的方法。第一轮试验仅利用一个引物的扩增结果尝试区分96个品种，但由于品种数量较多，有些同一育种单位的甜菜品种遗传背景较相似，亲缘关系较近，结果显示，7个引物单独标记虽都能将一定数量的甜菜品种区分，但无一能单独完全将96个甜菜品种区分开来；第二轮试验采取两两引物组合的方式尝试区分96个品种，共有21种组合方式，结果显示，21种引物组合方式中，仅有URP1F和URP17R两种引物组合能够将96个甜菜品种完全分离开，其余20种组合方式均未彻底将96个品种区分。但为了避免此实验结果是由于这两条引物的条带不清晰难以辨别而产生的偶然性实验结果，因此又增加了多态性较高的URP2R引物来保证实验结果的准确性。即利用URP1F、URP17R和URP2R三种引物组合构建96份甜菜品种的指纹图谱（全部指纹数据图谱略）。此处以URP2R引物对1-48号品种的扩增条带为例展示。

图1 引物URP2R对48个甜菜品种的扩增结果

2.2 遗传距离及聚类分析

根据PCR扩增条带，将扩增结果0、1数据导入MEGA 7.0进行遗传距离计算和聚类分析。96个品种的遗传距离变化范围在0.039～0.485之间，平均遗传距离0.237。其中最大遗传距离来自于品种63号和54号之间，63号品种IM1162来源于荷兰安地国际有限公司，54号品种KWS7125来源于KWS SAAT SE。最小遗传距离来自于品种26号LS1318和27号LN80891之间，均来源于英国莱恩种业。

利用UPGMA进行聚类分析。遗传距离位于0.17时，96个品种被分为两类，类群一仅由54号品种KWS7125组成，说明54号品种与其余95个品种遗传差异性较大。类群二在略小于0.17位置时又被分成两类，将43号品种KUHN1260与其余94个品种分离开，剩余聚类情况如图2所示。63号和38号、88号和22号、67号和8号、12号和7号两两遗传背景相似度较高，经查表1，他们均来源于荷兰安地国际有限公司。51号和56号、53号和52号、28号和87号遗传背景较相似，对照表1，他们都来自于荷兰安地国际有限公司和KWS SAAT SE，说明这两个育种单位的甜菜品种内部相似度较高。以上结果基本符合来源相同的品种其遗传背景也相近这一规律。

图2 96个甜菜品种的聚类分析图

3 讨论与结论

DAMD分子标记技术首先可以打破传统形态学鉴定的局限性，且DAMD分子标记技术相较于RFLP、SSR等技术，在操作上更加简便，同时还能具有良好的多态性和扩增条带的清晰性，使扩增结果更便于识别和分析。

本研究在前人基础之上，利用7个扩增效率高、结果稳定、条带清晰的DAMD引物对96个甜菜品种进行PCR扩增，根据扩增结果构建出一份甜菜品种独有的分子身份证，创建了一种快速鉴定甜菜品种的途径。研究结果成功将96个来源和遗传背景不尽相同的甜菜品种区分，对96个品种进行了遗传距离和聚类分析，构建了DAMD标记引物的甜菜品种分子身份证，使供试的96个甜菜品种都有自己的分子身份证。本研究为了能够进一步缩小引物范围使品种鉴定更加快速高效，又减少引物进行了聚类分析。共进行了两轮试验，在第二轮两两引物组合的21种方式中，发现URP1F和URP17R两种引物组合能够将96个甜菜品种完全分离开。96个甜菜品种被分为两类群，类群I仅有59号品种，类群II包含其余95个品种。但为了避免此结果为这两种引物条带不清难以辨别而产生的偶然性实验结果，因此又增加了多态性较高的URP2R引物来保证实验结果的准确性。最终成功利用URP1F、URP17R和URP2R三种引物组合构建出96份甜菜品种的分子身份证。本研究结论可用于快速鉴定甜菜品种，单独使用一个DAMD引物也可鉴定分离几十个甜菜品种，若7个引物同时使用，可鉴定上百个甜菜品种。

基于7个DAMD引物将96个供试甜菜品种完全鉴别分离的实验结果，本研究成功构建出甜菜品种的分子身份证，能够快速鉴定甜菜品种真实性，补充了通过形态学鉴定法区分甜菜品种而造成的局限，同时也进一步验证了利用DAMD引物鉴定甜菜品种的可行性和高效性。可以帮助有效解决市场相似品种混杂，假冒伪劣等问题，为保证育种家和农民的利益提供保障。