不同桑椹品种、物候期及贮藏条件下白藜芦醇的差异研究

王汗鑫，张 通，张凌峰，于明月，李红姣

（河北农业大学林学院/河北省林木种质资源与森林保护重点试验室，河北 保定 071000）

0 引言

桑椹是多年生木本植物桑树(Morus alba)的成熟果实，有黑、白、紫红、紫黑和红色多种颜色，其中紫黑色桑椹是补益上品，鲜食口感较好。由于桑椹含有丰富的氨基酸、维生素、花青素、白藜芦醇等营养和功能性物质，被誉为“第三代水果”[1]。桑椹也被医学界誉为“21世纪的最佳保健品”[2]。

白藜芦醇在植物中分布广泛，至今已在21科31属的72种植物中发现了白藜芦醇，且在一些植物中含量较高，如蓼科植物虎杖，其白藜芦醇含量高达干重的0.35%左右[3]。白藜芦醇具有抗菌消炎[4]、抗脂质过氧化[5]、抗衰老[6]等诸多药理作用，在药品、保健食品和化妆品等方面有着良好的应用前景，受到国内外学者的广泛关注和深入研究。据统计，全球每年需要白藜芦醇的需求量持续增加，但是生产与需求呈现负相关，供不应求，开发利用富含白藜芦醇的天然植物，优化成分分离技术，为植物成分有效利用和填补白藜芦醇应用市场具有重要意义[7]。目前对葡萄[8]、花生[9]等植物中白藜芦醇的研究较多。桑椹中富含白藜芦醇，据报道白藜芦醇的含量与桑椹采摘后放置时间有关[10]，桑椹果实与桑枝中白藜芦醇含量存在差异[11]。

本研究以不同品种、发育时期、贮藏方式处理的桑椹样品为材料，测定桑椹中白藜芦醇含量的品种差异及动态变化规律，旨在为合理利用桑椹中的白藜芦醇、桑椹的品种识别、品质评价、选种育种以及贮藏方法的选择等提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验地概况

桑园位于河北省定州市。地势相对平缓、海拔较低，年均气温12.4℃，温差小，年均日照2611.9 h，年均降水量为503.2 mm，无霜期191天，该地区四季分明，春秋季节温度适宜、干燥，夏季高温多雨，冬季寒冷少雪。

1.2 试验材料

1.2.1 桑椹材料选用‘孟简’、‘白玉王’、‘安椹’、‘龙桑’、‘中椹1号’、‘中椹2号’、‘中椹3号’等7个品种桑椹果实为试验材料，除‘白玉王’桑椹为乳白色外，其余品种的桑椹均为紫黑色。试验材料均人工采摘自河北省定州市东胜生态园内桑园。桑树均为5年生，树木管理措施一致。果实挑选大小均匀、无病虫害和机械损伤，从每棵树的东南西北等不同方位取样，10棵树为一小区，重复3次。

1.2.2 试剂 乙醇（上海阿拉丁生化科技股份有限公司）、壳聚糖（上海阿拉丁生化科技股份有限公司）、水杨酸（上海源叶生物科技有限公司）、1-MCP（上海阿拉丁生化科技股份有限公司）、茉莉酸甲酯（北京索莱宝科技有限公司），均为分析纯；白藜芦醇标品（上海源叶生物科技有限公司），为色谱纯。

1.2.3 仪器 飞鸽TGL-16aR型高速冷冻离心机（上海安亭科学仪器厂）、TU-1901双光束紫外可见光分光光度计（北京普析通用仪器厂）、DZRW-5型电热恒温水浴锅（北京中兴伟业仪器厂）、FA-N型电子分析天平（上海民侨精密科学仪器厂）、STARTER 2100 pH计（奥豪斯仪器（上海）有限公司）、RXZ人工智能气候箱（宁波江南仪器厂）、紫外灯灭菌箱（上海新诺仪器集团有限公司）、真空包装机（得力集团有限公司）。

1.3 试验方法

1.3.1 白藜芦醇的测定方法

（1）标准曲线的绘制。精密称取5 mg白藜芦醇标准品，用60%乙醇溶液溶解并定容至50 mL，即浓度为0.1 mg/mL的白藜芦醇溶液。再用60%乙醇溶液将该溶液稀释成浓度依次为0、0.05、0.1、0.15、0.2、0.25 mg/mL的白藜芦醇标准液。

取0.5 mL不同浓度的白藜芦醇溶液，加入60%乙醇溶液定容至10 mL测定OD305，横坐标为白藜芦醇标准液的浓度，纵坐标为OD305，绘制标准曲线，进行回归方程的计算。

（2）样品中白藜芦醇的测定。准确称取桑椹样品0.2 g，在研钵中充分研磨，按料液比1:15加入60%乙醇溶液混匀避光；60℃水浴加热1 h，过滤后，7000 r/min离心10 min，取得上清液；取上清液0.5 mL，用60%乙醇溶液稀释10倍，305 nm波长下测得吸光度，根据白藜芦醇标准曲线计算白藜芦醇的含量。

1.3.2 桑椹中白藜芦醇的品种差异 选用‘孟简’、‘白玉王’、‘安椹’、‘龙桑’、‘中椹 1 号’、‘中椹 2 号’、‘中椹3号’等7个品种桑椹果实为试验材料。采摘每个品种成熟桑椹样品，液氮速冻后带回试验室，-80℃贮藏备用，用于测定不同品种桑椹中白藜芦醇的含量。

1.3.3 桑椹果实不同发育时期白藜芦醇含量的变化规律选用‘孟简’、‘白玉王’、‘安椹’、‘龙桑’、‘中椹1号’、‘中椹2号’、‘中椹3号’等7个品种桑椹果实为试验材料。桑椹的生长发育进程分为坐果期、绿熟期、成熟前期、成熟期4个时期。分别于2019年4月23日（坐果期，坐果率95%以上）、5月3日（绿熟期；白色品种果实已经显著膨大，但是仍为绿色，即将开始变成白色，多数呈现黄绿色；紫黑色品种果实已经显著膨大，但是仍为绿色，即将开始变成红色）、5月13日（成熟前期；白色品种果实呈现白色，少数颜色发黄，外果皮有韧性，果柄柔韧呈嫩绿色，入口酸甜；紫黑色品种果实已经变成红色甚至紫红色，外果皮有韧性，果柄柔韧呈嫩绿色，入口酸甜）、5月23日（成熟期；外果皮柔软，极易破损，果柄干枯或脱落，白色品种果实呈现乳白色，紫黑色品种果实呈深紫黑色，口感甘甜多汁、入口即化）[12]的早晨进行人工采摘，样品采摘后液氮速冻带回试验室，-80℃贮藏备用，用于测定不同物候期桑椹中白藜芦醇的含量。

1.3.4 不同贮藏方式对桑椹中白藜芦醇含量的影响 选择的桑椹品种为‘中椹1号’（紫黑色品种）、‘白玉王’（白色品种）。选择成熟前期和成熟期的果实，将样品采摘后用冰盒迅速带回试验室，挑选健康、无机械伤的果实进行不同贮藏条件的处理。

（1）常温(24℃)贮藏：将采摘回来的桑椹样品放在室温下进行贮藏，每2天取样1次，直到50%以上果实腐烂为止。

（2）4℃冷藏：将采摘回来的桑椹样品放入4℃冰箱内冷藏。每2天取样1次，直到50%以上果实腐烂为止。

（3）自发气调贮藏：将样品放入密封袋子，再放入4℃恒温培养箱中保存。每2天取样1次，直到50%以上果实腐烂为止。

（4）减压（真空）贮藏：将样品放入密封袋内抽出空气使袋子内呈现真空状态再放入4℃恒温培养箱中保存，每2天取样1次，直到50%以上果实腐烂为止。

（5）紫外照射贮藏：将样品在紫外灯(≥300 lx)下照射10 min后放入4℃恒温培养箱中保存，每2天取样1次，直到50%以上果实腐烂为止。

（6）壳聚糖涂膜贮藏：将样品在1%壳聚糖溶液中浸泡涂膜浸泡1 min后取出，迅速沥干后放入4℃恒温培养箱中保存，每2天取样1次，直到50%以上果实腐烂为止。

（7）水杨酸涂膜贮藏：将样品在1%水杨酸溶液中浸泡涂膜浸泡1 min后取出，迅速沥干后放入4℃恒温培养箱中保存，每2天取样1次，直到50%以上果实腐烂为止。

（8）1-MCP熏蒸贮藏：将样品放在密闭的气调箱内，用1 μL/L 1-MCP溶液在4℃下熏蒸24 h，再将样品放入4℃恒温培养箱保存样品，每2天取样1次，直至50%以上果实腐烂为止。

（9）茉莉酸甲酯熏蒸贮藏：将样品放入密闭的气调箱内，用1 μmol/L茉莉酸甲酯溶液在4℃下熏蒸24 h，再将样品放入4℃恒温培养箱中保存，每2天取样1次，直到50%以上果实腐烂为止。

预试验结果表明，成熟期桑椹在常温贮藏、4℃冷藏和紫外照射贮藏时，在2天后均出现多数腐烂的现象，而桑椹为呼吸跃变型果实，1-MCP和茉莉酸甲酯熏蒸处理对成熟前期果实腐烂的抑制效果要好于成熟期果实，并且在熏蒸的过程中成熟期桑椹已经出现了大量腐烂的现象，因此，在后续的试验中，对成熟期桑椹贮藏方式的设置仅选择了自发气调贮藏、减压贮藏、壳聚糖涂膜贮藏、水杨酸涂膜贮藏4种。

将每种贮藏方式取出的样品液氮速冻后，放入-80℃冷冻设备中备用，用于测定不同贮藏条件下桑椹中白藜芦醇的含量。

1.3.5 数据分析 所有试验重复4次，用Excel 2010进行数据整理，使用SPSS 21.0软件对数据进行统计分析，采用Duncan法进行多重比较。

2 结果与分析

2.1 桑椹中白藜芦醇的品种差异

不同品种桑椹中白藜芦醇含量差异如图1所示。在相同栽培条件及气候条件下，不同品种间白藜芦醇含量存在一定差异，紫黑色桑椹果实白藜芦醇含量高于白色果实，‘中椹1号’与‘中椹3号’中白藜芦醇含量显著高于其他品种，这2个品种之间白藜芦醇含量没有显著差异(P＞0.05)。

图1 成熟期桑椹中白藜芦醇含量差异

2.2 不同发育时期桑椹中白藜芦醇含量的变化规律

不同发育时期桑椹果实白藜芦醇的含量变化规律如图2所示，桑椹中白藜芦醇含量随着发育时期的变化整体均呈现下降趋势。其中，‘孟简’坐果期白藜芦醇含量显著(P＜0.05)高于其他发育时期，果实成熟前期与成熟期白藜芦醇含量差异不显著；‘白玉王’和‘龙桑’4个发育时期白藜芦醇含量存在显著差异(P＜0.05)，以坐果期白藜芦醇含量最高；‘安椹’、‘中椹1号’、‘中椹2号’和‘中椹3号’坐果期和绿熟期白藜芦醇含量显著高于(P＜0.05)其他时期，这2个时期之间白藜芦醇含量差异不显著。表明各桑椹品种中白藜芦醇含量随发育时期的变化而发生变化，所测7个品种白藜芦醇合成集中于发育初期。试验材料中‘孟简’、‘白玉王’、‘安椹’、‘龙桑’4个品种在整个发育阶段坐果期白藜芦醇含量最高，‘中椹1号’、‘中椹2号’、‘中椹3号’3个品种在整个发育阶段绿熟期白藜芦醇含量最高，但均与坐果期没有显著差异。因此，为合理利用桑椹中的白藜芦醇，应选择适宜的发育时期对不同品种桑椹进行合理采收。

图2 不同发育时期桑椹中白藜芦醇含量变化

2.3 不同贮藏方式对桑椹中白藜芦醇含量的影响

桑椹属于呼吸跃变型果实，果实采摘后极易腐烂，果实中有效化学成分也发生较大变化，不同的贮藏方式对果实的贮藏效果影响有差异。

2.3.1 成熟前期‘中椹1号’常温、4℃冷藏处理、减压贮藏和茉莉酸甲酯熏蒸等处理均使白藜芦醇的含量有所上升，但常温、4℃冷藏处理在6月3日之后桑果50%以上腐烂，不再取样，壳聚糖涂膜处理使白藜芦醇含量先上升后下降，紫外照射使白藜芦醇含量先下降后上升，自发气调使白藜芦醇含量呈下降趋势，1-MCP和水杨酸涂膜处理的贮藏过程中，白藜芦醇含量波动变化无明显规律（图3）。随着贮藏时间的延长，在4℃冷藏、减压贮藏、壳聚糖涂膜贮藏及茉莉酸甲酯熏蒸贮藏等贮藏方式下白藜芦醇含量上升，说明在后熟的过程中白藜芦醇合成仍在继续，所以综合考虑贮藏时间和白藜芦醇含量，4℃冷藏、减压贮藏、壳聚糖涂膜贮藏及茉莉酸甲酯熏蒸贮藏为合适的贮藏方式。

图3 不同贮藏条件下成熟前期‘中椹1号’桑椹中白藜芦醇含量的变化规律

2.3.2 成熟前期‘白玉王’常温贮藏过程中，白藜芦醇含量呈下降趋势，4℃贮藏、自发气调条件贮藏、壳聚糖涂膜贮藏和水杨酸涂膜贮藏条件下白藜芦醇含量均呈现先上升后下降的趋势，紫外辐射处理使白藜芦醇含量先下降后上升，减压贮藏白藜芦醇含量无明显变化规律，1-MCP熏蒸条件下白藜芦醇含量随时间延长呈现波动变化，茉莉酸甲酯熏蒸贮藏过程中白藜芦醇含量随时间延长呈现波动变化没有一定规律（图4）。要对成熟前期‘白玉王’中白藜芦醇进行合理的提取利用，可以选择的贮藏方式有壳聚糖涂膜贮藏及水杨酸涂膜贮藏。

图4 不同贮藏条件下成熟前期‘白玉王’中白藜芦醇含量的变化

2.3.3 成熟期‘中椹1号’减压贮藏过程中白藜芦醇含量呈现先上升后下降的趋势，自发气调条件贮藏过程中白藜芦醇含量呈现先下降后上升，壳聚糖涂膜贮藏过程中白藜芦醇含量呈现先升后降的趋势，水杨酸涂膜贮藏过程中白藜芦醇含量呈现波动变化且没有一定规律（图5）。要对成熟期‘中椹1号’中白藜芦醇进行合理的提取利用，可以选择的贮藏方式为减压贮藏。

图5 不同贮藏条件下成熟期‘中椹1号’中白藜芦醇含量的变化

2.3.4 成熟期‘白玉王’减压贮藏过程中‘白玉王’白藜芦醇含量随时间的延长呈下降趋势，自发气调过程中白藜芦醇含量随时间延长呈现先上升后下降的趋势，壳聚糖涂膜及水杨酸涂膜贮藏过程中白藜芦醇含量随贮藏时间延长呈现波动变化（图6）。

图6 不同贮藏条件下成熟期‘白玉王’中白藜芦醇含量的变化

不同贮藏方式对于桑椹中白藜芦醇含量的变化较为复杂，可以选择常温、减压及茉莉酸甲酯熏蒸贮藏成熟前期‘中椹1号’对白藜芦醇进行提取利用；选择壳聚糖涂膜和水杨酸涂膜贮藏成熟前期‘白玉王’对白藜芦醇进行提取利用；选择减压贮藏成熟期‘中椹1号’对白藜芦醇进行提取利用；选择自发气调条件贮藏成熟期‘白玉王’对白藜芦醇进行提取利用。

3 结论

同一发育时期内不同品种、不同发育时期同一品种的桑椹中白藜芦醇含量存在差异。成熟期的桑椹，‘中椹1号’白藜芦醇含量最高；不同的发育时期，绿熟期‘中椹1号’、‘中椹2号’、‘中椹3号’中白藜芦醇含量最高，坐果期‘孟简’、‘白玉王’、‘安椹’、‘龙桑’白藜芦醇含量最高。自发气调、减压处理、紫外照射、壳聚糖涂膜、水杨酸涂膜浸泡、1-MCP熏蒸及茉莉酸甲酯熏蒸等贮藏方式均可以有效延长桑椹的贮藏时间，茉莉酸甲酯熏蒸、壳聚糖涂膜、减压贮藏和自发气调等处理方式可以有效保持白藜芦醇的含量。

4 讨论

植物中成分含量变化与品种有密切关系。白藜芦醇是植物遭到逆境刺激后体内产生的一种抗毒素[13]，是桑椹中重要的次生代谢产物。本研究表明同一物候期不同品种桑椹中白藜芦醇含量存在一定差异‘，中椹1号’等紫黑色品种中白藜芦醇含量高于白色品种中白藜芦醇含量，可能的原因是白藜芦醇含量受到相关合成酶活性（如PAL活性）的影响。以不同品种的葡萄为原料测定白藜芦醇的含量，发现不同的葡萄品种、不同的组织部位中白藜芦醇含量有差别[14]，同一发育时期不同品种酿酒葡萄中白藜芦醇含量也存在差异，白色品种含量低于有色品种，原因是成熟期有色品种中白藜芦醇合成关键酶PAL活性高于白色品种中PAL活性[15]，与本研究结果一致。

果实中有效成分含量变化受物候期的影响较大。Liu等[16]的研究表明，桃总酚含量在成熟过程中呈现不断下降趋势，品种间含量存在差异，并且在成熟期总酚抗氧化活性与总酚的含量呈正相关。本研究发现随着桑椹果实发育时期的变化白藜芦醇含量也发生变化。桑椹坐果期和绿熟期桑椹中白藜芦醇含量相对于成熟期较高，可能的原因是在桑椹发育初期果实中白藜芦醇合成相关酶比较活跃，使白藜芦醇得到积累。张燕等[17]以酿酒葡萄浆果为原料测定不同发育时期相关酶活性对白藜芦醇含量的影响，表明酿酒葡萄浆果中白藜芦醇含量在膨大期和始熟期达到峰值，原因是在酿酒葡萄浆果的膨大期和始熟期PAL、RS等相关酶活性高促使白藜芦醇含量积累[18]。坐果期和绿熟期白藜芦醇含量高但是单果重低，成熟前期和成熟期白藜芦醇含量低但是单果重，应综合考虑产量和白藜芦醇含量确定最适的采收期，在后续研究中会有所涉及。

不同贮藏条件对果实中有效化学成分的含量也有较大影响。茉莉酸甲酯在果实的贮藏过程中得到广泛应用[19]。茉莉酸甲酯处理在减少果胶减重、腐坏、硬度、果汁含量、抑制果胶甲基酯酶和纤维酶活性方面效果显著。Liu等[20]研究表明，茉莉酸甲酯熏蒸处理使樱桃番茄果实采后类胡萝卜素和抗坏血酸含量显著提高。本研究中成熟前期‘中椹1号’优选茉莉酸甲酯熏蒸贮藏，有利于对桑椹中白藜芦醇进行合理利用，同时可以有效延长桑椹贮藏时间，可能的原因是茉莉酸甲酯熏蒸调动了桑椹中白藜芦醇合成相关酶的活性，促进了白藜芦醇的合成，抑制呼吸跃变型果实桑椹中乙烯的释放，延缓了桑椹的衰老进程，有相似研究证明茉莉酸甲酯可以延长果实贮藏时间[21]。

壳聚糖涂膜能有效降低果实的呼吸速率，延长果实的贮藏期[22]。Adriana Pavinatto等[23]研究表明壳聚糖涂膜能提高草莓对真菌的抵抗能力从而保持草莓果实品质。此外，壳聚糖对草莓果实的影响主要是果胶代谢酶，特别是果胶甲基酯酶的软化抑制作用[24]。壳聚糖涂膜处理成熟前期‘白玉王’能有效延长桑椹贮藏时间，可能原因是壳聚糖在桑椹表面形成保护膜，促生了果实内部低氧高二氧化碳的微环境，有效抑制了果实的呼吸代谢速率，从而延缓果实了的软化进程，进而延长了贮藏时间[25]。

Zhang等[26]研究表明自发气调能有效调节石榴果皮活性氧代谢的各项指标，维持果实正常的生理活动，延缓组织细胞的成熟和衰老。成熟期‘白玉王’优选自发气调贮藏有效延长了桑椹贮藏时间，原因可能是自发气调调节了成熟期‘白玉王’的呼吸作用及其生理活动。