1例RHD*weak D type 72患者的血型鉴定及家系RHD基因序列分析

庄乃保，吴 凡，张艳艳，梁 爽，梁延连，苏宇清，彭 龙

（深圳市血液中心，广东深圳 518035）

Rh 血型系统是目前已发现的人类血型系统中最复杂、最具多态性的血型系统，其中RhD 抗原具有很强的免疫原性，是最重要的抗原。RhD 血型不合可引起致命的溶血性输血反应和严重的新生儿溶血病[1-2]。RhD抗原有很多变异型，包括弱D（Weak D）、部分D（Partial D）和D 放散型（D-elute，DEL）。许多报告显示[3-6]，多种RhD 变异型可引起RhD 阴性受血者的免疫反应，RhD 变异型个体也可被完整的RhD 抗原免疫产生所缺乏的表位对应的抗体。RHD*weak D type 72 等位基因于2007年在中国人群中首次发现（GenBank 登记号：EF103573），随后仅有个例报道[7-10]。本文分析1例RHD*weak D type 72 个体及其家系血清学表现和RHD 基因，现将结果报道如下。

1 材料与方法

1.1 研究对象 患儿（先证者），女，汉族，4 岁2 个月，右颞顶部硬下血肿，无输血史。采集先证者及其父亲、母亲静脉血液5 ml 置于EDTA 抗凝管中，4℃保存。本研究经深圳市血液中心伦理委员会批准，文中所涉及患者及其家系均已被告知实验内容并由本人/监护人签署知情同意书。

1.2 仪器与试剂 ID-Incubator 37 SI 保温箱，ID-Centrifuge 12 SII 台式离心机（ 瑞士Diamed AG 公司）；KA-2200 免疫血液学用离心机（日本KUBOTA 公司）；BD FACSCantoTMII 流式细胞仪（美国BD Bioscience 公司）；FL Auto 显微镜细胞成像仪，ProFlex PCR System（美国Life technologies 公司）；MAXWELL 16 DNA 提取仪（美国Promega 公司）；EP-1019 电泳仪（美国Embitec公司）；FluorChem R 多功能成像分析系统（美国ProteinSimple 公司）。

ABO 血型正/反定型和RhD 血型检测卡（其中抗-D 单抗为LDM3/175-2）、样本稀释液和微柱凝胶低离子抗人球蛋白卡（美国Bio-rad 公司）；抗-C，抗-c，抗-E，抗-e 单克隆IgM 抗体血型定型试剂、抗-D 单克隆IgG 抗体（MS-26）、抗IgG,Cd3d 抗人球蛋白检测试剂（上海血液生物公司）；抗-D IgM+IgG 血型定型试剂（175-2/D415 1E4）（加拿大Dominion 公司）；anti-D（TH-28/MS-26）（英国Millipore 公司）；荧光素FITC 标记抗体羊抗人IgG（美国Jackson Immuno Research公司）；DNA 提取试剂盒（美国Promega 公司）；人类红细胞RhD 基因分型试剂盒（天津市秀鹏公司）。

1.3 方法

1.3.1 ABO 及Rh 血型检测：采用ABO 血型正/反定型和RhD 血型检测卡检测先证者及其父母ABO和RhD 血型；采用单克隆IgM 抗体鉴定RhCcEe抗原。

1.3.2 先证者RhD 抗原检测：采用三种不同生产厂家的抗-D 定型试剂，使用试管间接抗球蛋白法（IAT）和微柱凝胶卡抗人球蛋白法进一步检测先证者RhD 抗原。显微镜观察试管IAT 法凝集情况。1.3.3 流式细胞术检测先证者RhD 抗原：200μg/ml 的抗-D 单克隆IgG 抗体100 μl 与1%样本红细胞生理盐水悬液50 μl 混合于微孔板中，37℃孵育30 min。空白对照孔加生理盐水100μl 与1%洗涤O 型RhD 阳性红细胞悬液50 μl 混合；阴性对照孔加200 μg/ml 的抗-D 单克隆IgG 抗体100 μl 与1%洗涤O 型RhD 阴性红细胞悬液50 μl 混合；阳性对照孔加 200μg/ml 的抗-D 单克隆IgG 抗体100 μl 与1%洗涤O 型RhD 阳性红细胞悬液50 μl混合。生理盐水洗涤3 次，加入10 μg/ml 荧光素FITC 标记抗体羊抗人IgG 100 μl/孔，37℃避光孵育30 min。生理盐水洗涤3次，最后一次洗涤后扣干，加生理盐水300 μl/孔稀释。流式细胞仪检测平均荧光强度。

1.3.4 基因组DNA 提取、PCR 扩增及RHD 基因分型：取300 μl 全血加入Blood DNA Purification Kit DNA 提取试剂盒样本槽中，采用MAXWELL 16 DNA 提取仪自动化提取全血DNA。每份DNA溶于300μl DNA buffer。测定所提取的DNA 浓度，低于2 ng/μl 的DNA 不能用于以下实验。使用人类红细胞RhD基因分型试剂盒，采用聚合酶链反应-序列特异性引物技术（PCR-SSP）进行PCR 扩增。PCR 扩增条件：96℃预变性2 min ；然后96℃变性20 s，68℃退火1 min，循环5 次；96℃变性20 s，65℃退火50 s，72℃延伸45 s，循环10 次；96℃变性20 s，62℃退火50 s，72℃延伸45 s，循环18 次；最后72℃延伸5 min，降温至4℃完成扩增。2.5g/dl 的琼脂糖凝胶电泳分析扩增产物。

1.3.5 RhD 杂合型分析：RHD 基因的两端存在两个具有98.6%同源性的区域，即Rh 盒子序列。当RHD 基因全缺失时，两端Rh 盒子融合为融合盒子。若样本可检出融合盒子，说明至少存在一条染色体RHD 基因全缺失。根据此原理特异性扩增Rh 融合盒子，判断先证者及其父母是否存在RHD 基因的缺失，由天津秀鹏生物技术有限公司完成。

1.3.6 RHD 基因编码区序列分析：测定RHD 基因的10 个外显子序列，将测序结果与参比序列Genebank BN000065 进行比对。引物合成和测序均由天津秀鹏生物技术有限公司完成。

1.4 统计学分析 使用IBM SPSS Statistics 20.0 统计软件分析平均荧光强度数据，计量数据采用均数±标准差(±s)表示，组间比较采用t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 血型血清学检测 见图1，图2。ABO 血型正/反定型和RhD 血型检测卡显示先证者为A 型RhDCcee，其母亲为A 型RhDCcee，父亲为O 型RhDCCee。先证者RhD 血型检测卡以及三种不同生产厂家抗-D 定型试剂微柱凝胶卡抗人球蛋白法结果均表现为部分凝集，显微镜观察间接抗球蛋白法结果为混合视野外观。

图1 先证者ABO 及RhD 血型微柱凝胶卡检测结果

图2 先证者RhD 血型试管IAT 法显微镜观察结果

2.2 流式细胞术检测先证者RhD 抗原 见图3。流式细胞术检测结果显示空白对照、阴性对照和阳性对照平均荧光强度分别为159.0±27.9，241.7±15.6，19 380.3±160.2（n=3）。先证者RhD抗原平均荧光强度为1 247.0±217.2（n= 3），分别与空白对照（t=9.320，P=0.011）、阴性对照（t=8.416，P=0.014）和阳性对照（t= -86.170，P=0.000）相比，差异均有统计学意义（均P＜0.05）。先证者RhD 抗原性较阳性对照弱，峰值左移；且峰型变宽，同时存在阳性和阴性反应细胞。

图3 先证者RhD 抗原流式细胞术检测结果

2.3 RHD 基因检测及家系调查 对照结果格局图判断特异性扩增产物，先证者及其父母PCR-SSP结果均为RhD 阳性，并排除中国汉族人群中常见的RHD*weak partial 15，RHD*DVI.3，RHD*DEL1等RhD 变异型。先证者及其母亲均检出Rh 融合盒子，说明存在一条染色体RHD 基因全缺失。先证者父亲融合盒子检测为阴性，说明不存在RHD 基因全缺失。见图4。经RHD 基因编码序列分析发现，先证者RHD 基因第9 外显子上的第1212 位碱基发生C ＞A 纯合突变，其父亲RHD 基因第 9外显子上的第1212 号碱基发生了C ＞A 的杂合突变，其母亲RHD 基因10 个外显子未检测到突变。RHD 基因第9 外显子第1212 位碱基C ＞A 突变为RHD*weak D type 72 的特征性突变点。

图4 先证者及其父母RHD 基因编码区序列分析结果

综合上述检测结果，家系调查显示先证者父亲基因型为RHD*weak D type 72 / RHD+；母亲基因型为RHD+ / RHD-。先证者RHD 基因第9 外显子第1212 位碱基C ＞A 突变遗传自其父亲，RHD基因全缺失的染色体遗传自其母亲，其基因型为RHD*weak D type 72 / RHD-。

3 讨论

Rh 血型系统是人类血型系统中最为复杂、最具多态性的1 个血型系统，D，C，c，E，e 为主要抗原，其中D 抗原具有很强的免疫原性。临床上根据个体是否存在RhD 抗原分为RhD 阳性和RhD 阴性。RhD 抗原有很多变异体，包括部分D，弱D 和D-elute。一般RhD 阳性个体红细胞膜RhD抗原数量为10 000 个左右，弱D 表型为900 个左右[11]。根据国际输血协会（International Society of Blood Transfusion，ISBT）等位基因命名表（table of ISBT allele nomenclature version v5.0. Available at: http://www.isbtweb.org/working-parties/red-cellimmunogenetics-and-blood-groug-terminolter），国际上已发现的弱D 型约150 种，其中我国已发现35种[10]。RHD*weak D type 72等位基因（c.1212C＞A，p. Asp 404 Glu）于2007年在GenBank 发布（登记号：EF103573），随后被ISBT 命名。2012年，吴筱莹等[7]在深圳地区无偿献血者RhD 血型鉴定中发现1 例RHD*weak D type 72 个体，该个体RhCE 表现型为Ccee，常规盐水法检测RhD 抗原为阴性，IAT检测为阳性，表位检测结果则与 RhD 阳性红细胞完全一致，提示RHD*weak D type 72 红细胞可能不存在 RhD 抗原表位缺失，只表现出 RhD 抗原的分子数量或抗体反应活性显著下降。2017年，JI 等[8]通过分析中国南方地区汉族人群RHD 基因和杂合型发现1 例RHD*weak D type 72 个体，该个体为CcDee 表现型，D-screen 试剂检测未发现表位缺失，IgM 型抗-D 抗体检测呈±～1+强度，IgG 型抗-D抗体检测呈2+或4+强度。2019年，ZHANG 等[9]在中国东北地区45 例血清学弱D 型分子结构分析中发现1 例RHD*weak D type 72 个体以及1 例RHD*weak D type 72 与RHD*DEL1 杂合个体，并应用生物信息学分析预测RHD*weak D type 72 的氨基酸置换位于胞内区。RHD*weak D type 72 等位基因自2007年在中国人群中首次发现，至今仅有以上个例报道。本研究中先证者RhD 血型经基因分型确定为RHD*weak D type 72。采用4 个不同厂家的抗-D 抗体试剂检测先证者样本，均表现为部分凝集的RhD 阳性结果。结合以往的报道[7-8]，可以判断RHD*weak D type 72 红细胞拥有基本完整的RhD 抗原表位。但对于该RhD 变异型研究较少，为安全起见，先证者仍应视为RhD 阴性受血者，输注RhD 阴性血液。

然而，以往的研究中未见RHD*weak D type 72血清学结果表现为部分凝集的报道。本研究中，排除操作错误、自身疾病以及异型红细胞输注史等情况，先证者RhD 血型鉴定经多次反复试验均表现为部分凝集。采用流式细胞术检测先证者RhD 抗原强度，结果显示先证者RhD 抗原性减弱；且先证者样本峰型变宽，同时存在阳性和阴性反应细胞，但未见双峰现象。分析本研究中微柱凝胶卡出现双群的原因为：微柱凝胶法的工作原理为利用凝胶分子筛筛选，当抗原抗体反应出现特异性凝集时，发生聚集的红细胞被拦截在凝胶上层，未反应的游离红细胞可沉降至凝胶底部。因血型抗原与对应抗体的结合是一种可逆的过程，RHD*weak D type 72 红细胞RhD 抗原与抗-D 抗体结合强度较弱，在微柱凝胶卡检测过程中，当离心产生的切应力超过抗原抗体结合的亲合力时，较弱的凝集有可能被分开而出现阴性结果，强凝集则仍被拦截在凝胶上层。目前，临床仍常规采用血清学方法检测RhD 血型[12-13]，本研究中RHD*weak D type 72 表现为部分凝集的血清学结果可为临床上对于RhD 血型的判断提供一定的参考，但本研究仍为个例报道，对于RHD*weak D type 72 的血清学特征仍需更为丰富的实验数据。

家系调查显示，先证者分别从父亲和母亲遗传RHD*weak D type 72 和RHD- 等位基因，其RHD*weak D type 72 等位基因由遗传获得，而非由个体基因变异形成。家系调查结果为后续RHD*weak D type 72 等位基因频率调查提供一定的参考意义。