肺鳞状细胞癌组织中LncRNA MIR205HG的表达及对癌细胞增殖克隆的影响和机制研究

沈运涛，蔡笃雄

（1.海口市琼山区妇幼保健院儿科，海口 571100；2. 海南医学院附属医院消化内科，海口 570102）

肺癌是全球范围内最常见的恶性肿瘤，非小细胞肺癌（NSCLC）发生率约占肺癌总发生率的80%～85%，其亚型中肺鳞状细胞癌死亡率较高，年死亡率约为40 万[1-3]。目前，针对特定基因靶向药物的开发已大大改善了肺鳞状细胞癌(squamous cell lung carcinoma, SQCLC)患者的治疗现状，然而仍有一小部分肺鳞状细胞癌患者具有驱动基因靶向治疗，导致5年生存率＜5%，原因是铂类化疗药的副作用[4]。因此，探究肺鳞状细胞癌的发病分子机制对于开发更有效的治疗方案显得至关重要。近年二代测序和生物信息学技术证实只有1%～2%的人类基因组可以编码蛋白质，没有编码潜力的RNA 根据长度被分成短链非编码RNA 和长链非编码RNA（lncRNAs，≥200nt）两个亚类[5]。研究表明，lncRNAs 通过多种机制对多种生物过程产生影响，包括翻译抑制、mRNA 降解、RNA 诱饵、招募染色质修饰因子、调节蛋白质活性等[6]，暗示lncRNAs 可作为预测患者预后生存的分子标志物[7]。且表明，lncRNAs 异常表达参与人类疾病的发展过程，特别是癌症的发生发展[8]。因此，本研究通过数据库筛选出肺鳞状细胞癌中差异性表达最显著lncRNA，并探究了其在肺鳞状细胞癌中的作用及其参与肺鳞状细胞癌发生发展的分子作用机制。

1 材料和方法

1.1 研究对象 人肺鳞状细胞癌细胞SK-MES-1 购于上海细胞库，含10g/dl 胎牛血清RPMI 1640 培养液培养，同时加入链霉素100 μg/ml 和青霉素100 IU/ml，培养在含5ml/dl 的CO2和95%湿度的37℃培养箱中。同时选取2020年12月期间本院收治的4 例人肺鳞状细胞癌患者癌组织及其对应正常肺组织标本进行研究，标本来自医院病理科，于低温液氮中保存备用。

1.2 仪器与试剂 胎牛血清、RPMI 1640 培养液（美国Gibco 公司），链霉素、青霉素（北京索莱宝科技有限公司），PCR 仪（美国Thermo Fisher Scientific 公司），逆转录试剂盒（日本Takara 公司），Lipo2000（美国Invitrogen 公司），酶标仪（美国Bio-rad 公司），MTS 反应液（南京凯基生物技术有限公司），MIR205HG 干扰siRNA 序列（上海吉玛制药技术有限公司）等。

1.3 方法

1.3.1 临床数据筛选及编码能力预测：检索GEPIA[9]临床数据库，以tumor/normal ＞2 为条件筛选出在肺鳞状细胞癌中差异性最高表达的lncRNA，并通过检索PholyCSF[10]数据库预测目的lncRNA 编码蛋白质的潜力。

1.3.2 实时荧光定量PCR 实验（RT-qPCR）：采用TRIzol 试剂盒提取细胞及组织总RNA，逆转录合成cDNA，并以此为模板配置PCR 反应体系为cDNA 4 μl，qPCR mix 5 μl，primer 1 μl，加ddH2O 至总体积为20 μl，行PCR 扩增反应。反应条件：95℃35 s，95℃ 20 s，72℃ 15 s，循环40 次。使用primer 3 设计特异性qPCR 引物，引物序列MIR205HG 正向：5’-GCGATGACATTCGCAGCG-3’，反向：5’-CA GTGCCTGTGCTGCAGT-3’；GAPDH 正向：5’-ACG AGAGTGCATGGCTCAC-3’，反向：5’-CGAGCAGG CTGTTCGTGTAG-3’；采用2-ΔΔCt法计算基因相对表达。

1.3.3 细胞转染：以6 孔板为例：将10 μl MIR205 HG-siRNA 与50 μl Opti-MEM 培养液混匀，将5 μl上述混匀液与2 μl 脂质体合并混匀，静置20 min后常规培养6 h，更换无血清培养液为完全培养液继续培养24 h，收集细胞进行后续实验检测。

1.3.4 细胞增殖实验检测：取转染后待测细胞以1×105个/孔铺于96 孔板，每组设3 个生物重复，培养48 h。按照MTS ∶培养液=1∶20 比例配制MTS 反应液，每孔加入反应溶液约100 μl，每30 min 检测一次吸光度。每孔加入150 μl 二甲基亚砜，置摇床低速振荡10 s，使结晶物充分溶解，490 nm处测各孔吸光度值，绘制细胞增殖曲线。

1.3.5 克隆形成实验检测：取转染后待测细胞以1×106个/孔铺于6 孔板，每个样品做3 个生物重复，培养至出现肉眼可见的克隆时收集细胞，PBS 洗涤两次，常温固定5 min，含0.5g/dl 结晶紫甲醇溶液固定15 min，水洗掉紫色背景，晾干扫描，10g/dl醋酸溶液溶解结晶紫，测量590 nm 处测吸光度值。

1.3.6 基因功能分析：检索cBioPortal[11]数据库找寻MIR205HG 的共表达基因，经metascape 行通路分析。

1.4 统计学分析 采用SPSS 20.0 软件进行实验结果分析，每个实验均设计三次重复，数据用均数±标准差（±s）表示。两组间比较采用独立样本t检验，癌组织及对应癌旁组织中差异比较采用配对t检验；多组间比较采用单因素方差分析，组内两两比较采用LSD检验；P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 筛选具有临床意义的LncRNA 研究检索GEPIA 数据库共找到在肺鳞状细胞癌中差异表达的lncRNA 有289 个，其中63 个在癌组织中高表达，226 个在正常组织中高表达，通过火山图筛选出在肺鳞状细胞癌中高表达且对比正常组织表达差异最显著的MIR205HG，见图1a。通过数据库发现，MIR205HG 仅在部分组织和肿瘤中表达，相较于肺腺癌，MIR205HG 仅在肺鳞状细胞癌中高表达（P＜0.05），见图1b；同时发现相比338 例正常组织（1.084±0.036），MIR205HG 在486 例肺鳞状组织（6.785±0.462）中显著高表达，差异有统计学意义（t=188.873，P=0.000），暗示了MIR205HG在肺癌且仅在肺鳞状细胞癌中具有作用。

图1 筛选具有临床意义的lncRNA

2.2 探究MIR205HG 在肺鳞状细胞癌中发挥功能的形式 研究通过PholyCSF 数据库对MIR205HG的编码能力进行预测，发现MIR205HG 不具有蛋白编码能力，其通过lncRNA 形式在肺鳞状细胞癌中发挥功能。

2.3 研究MIR205HG 在肺鳞状细胞癌中的重要性见图2。研究提取4 组临床正常肺组织和肺鳞状细胞癌组织中RNA，通过DNA 电泳（图2a）以及qPCR 实验（图2b），均验证了MIR205HG 在肺鳞状细胞癌组织中高表达（P＜0.05）；通过检索GEPIA 数据库发现，临床分期越高MIR205HG 表达水平越高（P=0.047 2，图2c）。通过转染2 条shRNA至肺鳞状细胞癌细胞，检测发现shMIR205HG#1 组和shMIR205HG#2 组细胞中MIR205HG 表达分别为0.289±0.046，0.304±0.051，明显低于转染无义序列shCTL 对照组的1.000±0.003，差异有统计学意义（F=314.271，P＜0.001），提示敲降MIR205HG 表达转染成功。细胞增殖实验检测显示，转染72h 时shMIR205HG#1 组和shMIR205HG#2组细胞增殖率分别为0.709±0.032，0.736±0.026，明显低于shCTL 对照组的0.988±0.039，差异有统计学意义（F=66.163，P＜0.001）。细胞克隆实验检测发现shMIR205HG#1 组和shMIR205HG#2 组细胞克隆形成速率分别为0.324±0.021，0.402±0.023，亦明显低于shCTL 对照组的1.809±0.019，差异有统计学意义（F=423.093，P＜0.001），提示敲低MIR205HG 表达可明显抑制肺鳞状细胞癌细胞的增殖及克隆形成。

2.4 探究MIR205HG 在肺鳞状细胞癌中发挥功能的作用方式 见图3。研究在数据库中找到与MIR205HG 共表达的基因，通过KEGG 和HallMark信号通路分析发现，MIR205HG 可能参与P53 这个重要的致癌信号通路（图3a）。通过蛋白质免疫印迹验证发现，转染shRNA 介导敲低MIR205HG 时，shMIR205HG#1 组和shMIR205HG#2 组细胞中P53表达分别为5.988±0.321，5.702±0.345，下游重要的P21 蛋白表达分别为3.857±0.362，3.698±0.314，均明显高于shCTL 对照组的1.022±0. 152，1.106±0.253，差异均有统计学意义（F=285.386，73.106，均P＜0.001，图3b），提示MIR205HG 可能通过下调P53 以及抑制其介导的信号通路，从而促进肺鳞状细胞癌的生长增殖。

图2 研究MIR205HG 在肺鳞状细胞癌中的重要性

图3 探究MIR205HG 在肺鳞状细胞癌中发挥功能的作用方式

3 讨论

近年，越来越多证据发现LncRNA 参与了包括肺癌在内的多种癌症的进展和转移[12]，为肿瘤的临床研究及诊治提供了新的目标和思路。lncRNA是一类转录物大小超过200 个核苷酸的非编码RNA[8]。LncRNA 在结构上与mRNA 相似，但其具有更高的组织表达特异度[13]。LncRNAs 可作为识别癌症的特异性生物标志物和功能驱动因子。大量研究表明，LncRNAs 在肿瘤的发生发展和化学耐药中都起着重要作用，例如：LncRNAs CCAT1 下调增强了人结肠癌细胞对5-氟尿嘧啶的敏感度[14]。LncRNAs-GAS5/miR-221-3p/DKK2 轴通过Wnt/βcatenin 信号通路调控abcb1 介导的乳腺癌阿霉素耐药[15]。LncRNA TUC338 通过激活MAPK 通路促进了肺癌的增殖、侵袭及迁移[16]。近年众多研究也发现，多种lncRNAs 与肺癌的发生发展密切相关，例如LncRNA MALAT1 通过调节miR - 124/STAT3 轴参与非小细胞肺癌的发生[17]。体外实验表明，敲低PVT1 会抑制肺鳞状细胞癌的细胞增殖、迁移和侵袭[18]。CCAT2 通过调节Wnt /β-catenin 信号通路促进肺鳞状细胞癌的发生[19]。因此，找寻更多肺鳞状细胞癌中特异性表达的分子靶标，探究其表达发挥作用对临床治疗及攻克意义显著。

本研究首先通过GEPIA 数据库找到在肺癌中差异表达的lncRNA 有289 个，进一步筛选到在肺癌中过表达且相比于正常组织表达差异最明显的MIR205HG 作为研究目的基因，探究发现其主要通过lncRNA 形式在肺鳞状细胞癌中发挥功能。既往相关研究发现，LncRNA MIR205HG 通过调控miR-122-5p 加速宫颈癌肿瘤细胞的生长进展[20]。lncRNA MIR205HG 能够引起Hsa-miR-590-3p 缺失导致头颈部鳞状细胞癌不受抑制的增殖，促进其发展进程[21]。LncRNA MIR205HG 通过miR-299-3p/VEGFA 轴支持黑色素瘤的生长，是黑色素瘤治疗的潜在靶点[22]。LncRNA MIR205HG 在食管腺癌细胞中表达下调，其过表达可抑制体外细胞的增殖和细胞周期进程，涉及对Hh 信号通路的调控作用[23]；且发现通过调控miR-214/SOX4 轴驱动了食管鳞状细胞癌的进展[24]。提示MIR205HG 在临床癌症中的癌基因作用，故进一步探究其在肺鳞状细胞癌中的作用机制十分必要。研究通过经典的分子生物学实验验证发现MIR205HG 可促进肺鳞状细胞癌的生长增殖和克隆形成。进一步分析发现MIR205HG可能参与P53 致癌的信号通路。P53 关键靶基因P21 和14-3-3σ 在几种类型的人类肿瘤中的异常表达，被认为是肿瘤抑制因子，以P53 依赖性方式发挥功能[25]。而研究通过敲低MIR205HG 对P53 及其关键靶基因的表达进行验证，发现敲降其表达会促进P53 以及其下游关键靶基因P21, 14-3-3σ 的表达，由此说明了MIR205HG 可能通过调控P53 表达，并阻断其参与的信号通路来发挥作用参与肺鳞状细胞癌发生发展。本研究从基因筛选、发挥作用形式、功能验证和作用机制探讨四个方面探究了MIR205HG 在肺鳞状细胞癌中的重要作用，但其功能机制尚不够全面深入，故后期还需进一步的研究阐明。

综上所述，lncRNA MIR205HG 在肺鳞状细胞癌中显著高表达，其参与调控肺鳞状细胞癌的增殖与P53 信号通路密切相关，可将其作为肺鳞状细胞癌的潜在药物治疗靶点。