不同日龄黄淮白山羊子宫组织结构增龄性变化观察

张文静， 汪来香， 顾有方， 胡 博， 周金星

(安徽科技学院 动物科学学院 安徽省动物营养调控与健康重点实验室，安徽 凤阳 233100)

子宫是胚胎附植及孕育胎儿的器官，在动物生长发育过程中子宫经历一系列有规律的周期性变化。子宫从内到外分为内膜、肌层和外膜三层，其中子宫内膜是胚胎植入的关键，对动物妊娠、繁殖具有重要意义[1]。目前，国内外学者对动物子宫组织结构的研究主要有牦牛发情周期子宫组织结构的观察[2]、超数排卵处理对小鼠子宫组织结构的影响[3]、兔不同时期子宫组织结构变化的研究[4-5]、蝙蝠雌性生殖器官在不同生殖阶段的组织形态变化[6]、水牛发情周期子宫的组织学和组织形态计量学变化[7]等。

黄淮白山羊因广泛分布在黄淮流域而得名，是繁殖性能较高的肉皮兼用品种之一，也是安徽省优良的地方品种之一，对不同生态环境有较强的适应性，抗病力和繁殖力强。目前，对黄淮白山羊的组织形态学研究主要集中在蹄部[8]、舌黏膜[9]、毛囊皮肤[10]、心脏冠状动脉[11]、胸腺[12]和肠道黏膜[13-14]等器官组织结构的观察。对于黄淮白山羊子宫的形态结构特点尚无报道。因此，本研究通过不同日龄黄淮白山羊子宫的组织结构增龄性变化观察，以期为黄淮白山羊子宫形态学研究提供基础资料。

1 材料和方法

1.1 试验动物

20只2～3岁健康雌性黄淮白山羊选自安徽利辛绿墅农牧有限公司,同期发情处理,并采用人工授精技术使之妊娠，精液来自2～3岁健康黄淮白山羊公羊。健康母羔羊按日龄分为5组：3、30、60、90和120日龄组，每个日龄组选取体质均一的3只宰杀，共计15只。母羊与羔羊均采用舍饲，自由采食饮水。

1.2 样品采集

各日龄组山羊均经颈动脉放血处死后，迅速剖检取子宫立即放入4%中性多聚甲醛溶液中固定备用。

1.3 主要仪器设备

RM2235手动轮转式切片机(德国徕卡);HI1210摊片机(德国徕卡);HI1220烘片机(德国徕卡);BX63正置荧光显微镜(日本奥林巴斯)。

1.4 石蜡切片制作

取固定好的不同日龄黄淮白山羊子宫组织，流水冲洗24 h，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，浸蜡，常规石蜡包埋，制作5 μm厚切片，进行HE、阿利新蓝过碘酸雪夫氏(AB-PAS)和Verhoeff VG(VVG)染色，显微镜观察并照相。

1.5 图像统计分析

用Olympus BX63(DP74)显微成像系统对子宫切片进行观察。每只羊取10张组织切片，在100倍放大倍数下，每张切片随机选5个视野观察。利用Image Pro Plus 6.0图像分析软件和显微测微系统对相关参数进行测量。包括：(1)子宫内膜和子宫肌层厚度(子宫内膜厚度包括子宫肉阜和子宫区间厚度，均采用最高点进行测量)；(2)子宫内膜的黏膜上皮和腺上皮高度；(3)每平方毫米子宫内膜内子宫腺管的数量。利用SPSS 22.0统计分析软件对数据进行单因素方差分析，所有试验数据采用平均数±标准差表示。

2 结果与分析

2.1 不同日龄黄淮白山羊子宫组织结构变化特点

黄淮白山羊子宫壁从内至外可分为内膜层、肌层和外膜3层。子宫内膜上皮为假复层柱状上皮或单层柱状上皮，上皮细胞有分泌功能。固有层分浅层和深层，浅层位于内膜上皮下方，靠近子宫腔体，主要由疏松结缔组织构成，内含大量细胞、纤维和血管；深层细胞成分较少，有大量分支管状的子宫腺，与肌层相邻，为基底层。

2.1.1 3日龄黄淮白山羊子宫组织结构特点 3日龄子宫内膜的黏膜层由上皮和固有层构成，见少量黏膜皱襞，上皮为假复层柱状上皮，有少量微绒毛结构，子宫肌层由内环、外纵平滑肌组成，外膜属浆膜性结构，由疏松结缔组织构成，3日龄肌层，外膜较薄(图1A)。上皮细胞由大量分泌细胞组成，细胞呈高柱状，体积较大，胞核染色深，位于细胞中央呈椭圆形，胞质弱嗜酸性，上皮顶部见分泌细胞含核的突起。上皮间有散在的淋巴细胞，主要分布于基膜上，少数见于上皮细胞之上(图1B)。AB-PAS染色可见子宫内膜的黏膜上皮和血管上皮有阳性反应，但颜色较浅，含量少(图2A)。VVG染色未观察到纤维分布(图2B)。可观察到子宫腺发育形态，但极少见发育完整的子宫腺体(图3A)。

2.1.2 30日龄黄淮白山羊子宫组织结构特点 30日龄子宫内膜的黏膜上皮已由假复层柱状纤毛上皮转变为单层柱状上皮，肌层，外膜均增厚(图1C)。黏膜上皮细胞呈“栅栏状”排列，主要由分泌细胞构成，游离面见大量微绒毛结构，细胞呈方柱状，体积较3日龄变大。黏膜的固有层中可见大量的淋巴细胞分布(图1D)。AB-PAS染色可见基膜呈强阳性反应，黏膜上皮阳性分泌颗粒增多(图2C)。VVG染色固有层中已能观察到少量胶原纤维(图2D)。子宫腺体发育完整，但数量较少(图3B)。

2.1.3 60日龄黄淮白山羊子宫组织结构特点 60日龄子宫形态发育完全，子宫内膜的黏膜层上皮细胞显著变矮，游离面可见微绒毛结构，内环、外纵肌中间有丰富的血管及淋巴管，为子宫内膜提供营养。外膜厚度与30日龄相差不大，但外纵肌增厚明显(图1E)。子宫内膜的黏膜上皮和腺上皮之间可观察到散在的淋巴细胞(图1F)。AB-PAS染色可见其子宫内膜的黏膜上皮、腺上皮和基质中均有阳性分泌颗粒，其中基膜和黏膜上皮呈强阳性反应，而腺上皮和基质中含量较少(图2E)。VVG染色显示胶原纤维增多(图2F)。子宫腺数量明显增多，并观察到固有层中深层子宫腺体(图3C)和浅层正在增殖发育的子宫腺体(图3D)。腺上皮为单层柱状上皮，深层子宫腺上皮细胞排列整齐，细胞呈长杆状或锥形，染色深，胞质强嗜酸性；浅层子宫腺上皮细胞呈卵圆形，染色浅，胞质弱嗜酸性。

2.1.4 90日龄黄淮白山羊子宫组织结构特点 90日龄子宫肌层，外膜增厚(图1G)。子宫内膜的黏膜层上皮细胞呈矮柱状，黏膜上皮和腺上皮之间仍可观察到散在的淋巴细胞(图 1H)。AB-PAS染色可见子宫内膜的黏膜上皮、腺上皮和固有层基质中阳性反应增多(图2G)。VVG染色可见较丰富的胶原纤维(图2H)。深层子宫腺上皮增生出现少量弯曲(图3E)。浅层子宫腺发育完全，主分布于近子宫内膜的黏膜上皮处(图3F)。

2.1.5 120日龄黄淮白山羊子宫结构特点 随着子宫的发育，120日龄子宫肌层、外膜持续增厚，此时肌层的内环肌较外纵肌厚(图1I)。子宫内膜的黏膜上皮细胞呈圆柱状，胞质突向子宫腔，黏膜上皮和腺上皮之间有散在淋巴细胞分布(图1J)。AB-PAS染色可见子宫内膜的黏膜上皮和固有层中阳性反应颗粒含量多(图2I)。VVG染色可见分布规律的成纤维细胞和大量的胶原纤维(图2J)。子宫腺上皮细胞胞质突起，深层子宫腺稠密，腺变长而弯曲，子宫腺腔内见分泌物(图3G)。浅层子宫腺体积大而圆，数量少于深层(图3H)。

图1 不同日龄黄淮白山羊子宫组织结构

图2 不同日龄黄淮白山羊子宫糖原和纤维的分布

图3 不同日龄黄淮白山羊子宫腺发育形态

2.2 不同日龄黄淮白山羊子宫组织结构的形态学比较

2.2.1 子宫内膜的黏膜上皮和腺上皮高度 黄淮白山羊不同日龄子宫内膜上皮和腺上皮变化明显。图4表明，3和120日龄子宫肉阜上皮、肉阜区间上皮高度差异不显著(P>0.05)，与90日龄差异显著(P<0.05)。3日龄为假复层柱状上皮，其他日龄为单层柱状上皮。30和60日龄子宫肉阜上皮、肉阜区间上皮高度差异不显著(P>0.05)。3、30和60日龄子宫腺上皮高度差异不显著(P>0.05)，与90日龄差异显著(P<0.05)。90和120日龄子宫腺上皮高度差异不显著(P>0.05)。

图4 不同日龄黄淮白山羊内膜上皮和腺上皮高度

2.2.2 子宫内膜和子宫肌层厚度 图5表明，3～120日龄子宫肉阜、子宫肉阜区间和子宫肌层的厚度呈显著上升趋势(P<0.05)且达到峰值。3与30日龄子宫肉阜和子宫肉阜区间厚度差异不显著(P>0.05)，30～120日龄子宫肉阜和子宫肉阜区间厚度差异显著(P<0.05)，其中60日龄与90、120日龄差异极显著(P<0.01)。3、30和60日龄子宫肌层厚度差异不显著(P>0.05)，60日龄与90和120日龄子宫肌层厚度差异显著(P<0.05)。

图5 不同日龄黄淮白山羊子宫壁各层的厚度

2.2.3 黄淮白山羊子宫腺数量分布 图6表明,黄淮白山羊不同日龄时期子宫腺数量变化明显，3和30日龄子宫腺数量差异不显著(P>0.05)，与60日龄差异显著(P<0.05)，且达到峰值。90和120日龄差异不显著(P>0.05)，与60日龄差异显著(P<0.05)。

图6 不同日龄黄淮白山羊子宫腺数量

3 结论与讨论

动物子宫是受孕、胚胎植入、生长和胎盘形成的关键，与胎儿成活、产仔密切相关。本试验观察发现黄淮白山羊子宫的一般组织结构与绵羊[15]、猪[16]、牛[17]、鼠[18]等哺乳动物子宫结构类似。子宫内膜的黏膜上皮类型随日龄增加由假复层纤毛上皮分裂增生为排列整齐紧密的单层柱状上皮，且由高柱状随日龄增加逐渐变化为矮柱状和圆柱状，120日龄时子宫内膜的黏膜上皮细胞呈高圆柱状，此年龄段上皮细胞活性显著。张日华等[19]在雌激素对子宫的作用研究中发现，动物去势后在雌激素的替代下，子宫内膜明显增厚,子宫内膜的黏膜上皮细胞显著增大。因此，研究推测黄淮白山羊子宫增厚，子宫内膜上皮增高是雌激素和动物生长发育的结果。黄淮白山羊子宫内膜的黏膜上皮主要由分泌细胞构成，黏膜上皮和腺上皮中有散在的淋巴细胞分布，与Wiley等[15]对绵羊子宫观察的结果一致。此外，陈秋生等[20]在双峰驼子宫黏膜上皮和子宫腺上皮中也观察到上皮内淋巴细胞，认为子宫内有丰富的弥散免疫细胞，尤其子宫腺是参与黏膜免疫的重要组成部分。因此推测黄淮白山羊子宫黏膜是其行使黏膜免疫功能的重要组成部分。本研究利用ABPAS试验方法观察到不同日龄黄淮白山羊子宫内膜中糖原的分布，随日龄的增长PAS阳性反应逐渐增强。子宫内膜基质中主要成分是粘多糖，其主要功能是为子宫发育维持内坏境稳定和胚胎发育提供能量，且子宫分泌产物是建立子宫容受性和着床的明确要求[21]。Billings等[22]研究表明子宫内膜腺分泌糖原、糖蛋白、粘多糖和各种酶，子宫内膜腺的分泌主要是由腺上皮分泌和内膜上皮分泌。子宫腺的分泌方式主要是顶浆分泌[23]。本研究发现黄淮白山羊子宫内膜上皮和腺上皮在120日龄时胞质突起，上皮细胞增厚，形成顶浆分泌，因此120日龄时子宫内膜和基质中阳性反应最高；Spencer等[24]人研究结果表明，绵羊子宫腺在0～7日龄开始发育，56日龄子宫腺组织结构上已经发育完整，但最终成熟和生长要等性成熟以后。Bukar等[25]研究发现萨赫勒山羊3月龄时子宫组织形态发育完成，猪[16]的子宫组织结构在120天内发育成熟。本研究发现黄淮白山羊出生后3日龄观察到正在发育中的子宫腺体，到60日龄时腺体数量最多，120日龄时腺体形态和结构发育成熟；Allison等[26]认为子宫内膜腺体及其分泌物对胚胎发育至关重要，细胞表面和分泌蛋白表达与子宫组织形态有关。本研究结果表明，黄淮白山羊120日龄时子宫内膜和子宫腺管中可观察到大量糖原分布，此时子宫腺发育成熟。

通过本研究观察，可见子宫内膜固有层中有胶原纤维成分，从30日龄开始观察到纤维出现，随日龄增长纤维成分增多，到120日龄时大量的胶原纤维分布于子宫内膜固有层中，胶原纤维对妊娠有重要作用。子宫内膜和子宫肌层厚度在90日龄左右增长迅速，这与Ramos等[27]对犬子宫组织形态的研究结果一致，子宫内膜、肌层在3月龄时发育最明显。黄淮白山羊120日龄时子宫内膜和子宫肌层厚度达到最佳状态。黄淮白山羊120日龄子宫上皮细胞活性显著，子宫腺发达，糖原分泌物增多、纤维成分丰富，内膜平滑肌发达，此时子宫组织结构发育成熟。