斑马鱼腺苷甲硫氨酸脱羧酶基因短片段缺失突变体的构建与鉴定*

张 可，王小玉，黄淑莹，夏佳敏，黄四洲

1.成都医学院基础医学院(成都 610500); 2.成都医学院 发育与再生四川省重点实验室(成都 610500);3.成都医学院 药学院(成都 610500); 4.成都医学院基础医学院 人体解剖与组织胚胎学教研室(成都 610500)

多胺是一种低分子量的简单脂肪胺，存在于绝大部分生物体内。在哺乳动物中，多胺对蛋白质的合成、抗氧化损伤、离子通道活性、细胞增殖等起着重要作用[1-2]。腐胺、亚精胺和精胺是真核系统中多胺的主要成分，由鸟氨酸或S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosyl-methionine，SAM)在鸟氨酸脱羧酶(ornithine decarboxylase，ODC)作用下脱羧而成。这条合成途径需要1个氨基丙基，由腺苷甲硫氨酸脱羧酶(adenosylmethionine decarboxylase 1,AMD1)提供，故AMD1是合成精胺和亚精胺的关键调控酶[3]。AMD1在多种癌组织中高表达，是治疗肿瘤的潜在靶点之一。在慢性粒细胞白血病(chronic myelocytic leukemia，CML)慢性期向急变期发展的过程中，AMD1的表达明显上调，与CML患者预后不良有关[4]。AMD1在雷帕霉素靶蛋白激活的前列腺癌组织中高表达，提示AMD1或可作为治疗该疾病的潜在靶点[5]。AMD1在肝癌组织中表达上调，是肝癌预后不良的因素之一[6]。有研究[7]表明，AMD1与人胃癌的恶性程度密切相关。AMD1在各类肿瘤中的作用已有相关报道，但在胚胎发育过程中的作用及机制尚未明确。

随着ZFN[8]、TALEN[9]、CRISPR/Cas9[10]等基因编辑技术的广泛应用，突变体的快速鉴定成为了一项重要工作。Cas9蛋白在向导RNA(single guide RNA, sgRNA)的引导下对靶点进行切割，可产生不同的突变类型：长片段缺失可在琼脂糖凝胶电泳上出现多个条带；短片段缺失以第二代DNA测序技术[11]为主要验证方法，但该技术所需时间长，因此需寻找一种快速鉴定短片段缺失的检测方法。斑马鱼单次产卵量大、发育周期短、胚胎透明，是研究胚胎发育的理想模型[12-13]。本研究以斑马鱼为实验动物，利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建斑马鱼amd1突变体，并针对突变的碱基位点设计特异性引物，运用聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)技术建立快速鉴定短片段缺失的方法，以期为进一步研究amd1在胚胎发育中的作用提供基础。

1 材料与方法

1.1 实验动物

野生型(wild type,WT)斑马鱼(AB品系)严格按照标准饲养条件喂养:成年斑马鱼在28.5 ℃系统水中养殖，系统水保持每日紫外线照射，pH常年稳定在7.6左右。

1.2 试剂与仪器

实验试剂主要包括Prim STAR Max(Takara公司,美国);T7转录试剂盒(NEB公司，美国);T3 Super PCR Mix(Tsingke公司，北京);EnGen Cas9 NLS(NEB公司，美国);cycle pure kit(OMEGA公司，美国);探针合成试剂盒(Roche公司，瑞士)。实验仪器主要包括斑马鱼气动皮升显微注射泵PV820(WPI公司，美国);SZX2-ILLT荧光显微镜(Olympus公司，日本);PCR核酸扩增仪(BIO-RAD公司，美国)。

1.3 方法

1.3.1 CRISPR/Cas9靶点及验证引物设计 斑马鱼amd1基因的全长序列在NCBI网站上下载，根据CRISPR/Cas9靶点的设计原则，设计2个sgRNA靶点序列(sgRNA1和sgRNA2)。经BLAST比对发现，2个靶点均在斑马鱼基因组中具有特异性，根据2个sgRNA靶点序列设计验证引物amd1-check-5′和amd1-check-3′(表1)。

表1 靶点和验证引物序列

1.3.2 sgRNA的合成与纯化 以amd1-sgRNA1、oligo2与amd1-sgRNA2、oligo2为引物，按照PCR反应程序(98 ℃预变性3 min,98 ℃变性10 s，55 ℃退火15 s，72 ℃延伸10 s，35个循环,72 ℃再延伸5 min)分别合成PCR产物。将二者混合后用PCR试剂盒回收纯化，得到合成sgRNA模板，随后进行转录获得sgRNA。转录产物回收纯化后，测定浓度并进行电泳检测，分装保存于-80 ℃冰箱备用。

1.3.3 显微注射 在注射的前一晚，将1对成年WT斑马鱼放在交配缸中，加入适量的系统水后，将雌鱼和雄鱼用挡板隔开，在次日8∶00拔掉挡板，让雌、雄鱼交配，10 min左右即可产生受精卵。按照Cas9蛋白200 ng/μL、sgRNA 150 ng/μL配制注射溶液，在斑马鱼胚胎1细胞期注射1 nL混合溶液于细胞中，注射完毕后放入28.5 ℃的孵育箱继续培养48 h，定期更换系统水。

1.3.4 检测sgRNA及筛选突变体 从“1.3.3”制备的斑马鱼胚胎中，随机挑选4个发育畸形的胚胎和6个发育正常的胚胎于PCR管中，每管加入50 μL DNA裂解液，按照PCR程序(55 ℃ 5 h，95 ℃ 10 min，12 ℃ 2 h)获得斑马鱼基因组DNA。以amd1-check-5′和amd1-check-3′为引物扩增DNA，通过第二代DNA测序技术判断靶点是否有效。若有效，将剩余的斑马鱼胚胎喂养至性成熟，即为F0代;F0代与WT斑马鱼交配得到F1代;通过拔鱼鳞提取DNA，PCR技术扩增DNA后送测序，得到F1代杂合子;F1代与WT斑马鱼交配后，测序筛选出F2代杂合子;将突变类型一致的F2代自交，得到F3代。通过PCR技术筛选F3代纯合子，第二代DNA测序技术对结果进行验证。

1.3.5 设计鉴定纯合子的引物 针对突变的碱基位点，设计4个引物，amd1-screen-(1)-5′至amd1-screen-(4)-5′，4个鉴定引物分别和amd1-check-3′为4对上、下游引物，以amd1纯合子斑马鱼DNA为模板，按照PCR程序(98 ℃预变性3 min，98 ℃变性10 s，58 ℃退火10 s，72 ℃延伸15 s，35个循环，72 ℃再延伸5 min，12 ℃ 2 h)扩增DNA,通过琼脂糖凝胶电泳检测，无条带为纯合子，对应引物为最佳鉴定引物(表2)。

表2 纯合子鉴定引物序列

1.3.6 探针的制备及原位杂交 以线性化载体为模板，用探针合成试剂盒合成地高辛标记的RNA反义探针，异丙醇纯化后用电泳检测条带是否正确，最后保存于-20 ℃备用。收集斑马鱼胚胎，用4%多聚甲醛固定，于4 ℃冰箱保存，第2天用PBST溶液洗3次，5 min/次，然后用无水甲醇脱水，15 min/次，放入-20 ℃冰箱保存。原位杂交技术按照文献[14]步骤进行。

1.3.7 荧光体视显微镜拍照 原位杂交后的胚胎用100%甘油固定后，用荧光显微镜观察并拍照。

2 结果

2.1 sgRNA对斑马鱼amd1基因特异位点的编辑

针对amd1基因靶点设计特异性sgRNA,并在体外转录合成(图1A)。F0代斑马鱼胚胎提取基因组DNA后，用PCR扩增该靶标区域DNA(图1B)。测序结果显示，在靶点处(红色方框内序列为Cas9蛋白靶点)出现套峰(图1C)，sgRNA可对amd1特异位点进行编辑。

图1 sgRNA对斑马鱼amd1基因特异位点的编辑

2.2 斑马鱼amd1突变体的构建结果

测序结果显示，F1代斑马鱼胚胎存在2种突变类型(图2A～B)。WT斑马鱼胚胎在CDS区域1 002 bp处出现终止密码子，而这2种突变体分别在168、141 bp处提前产生终止密码子，导致翻译提前终止，这2种突变类型均为错义突变(图2C)。成年的F1代amd1杂合子斑马鱼与WT斑马鱼杂交，测序筛选出F2代杂合子，自交后得到纯合子、杂合子、WT的比例约为1∶2∶1，符合孟德尔遗传定律，最终得到稳定遗传的斑马鱼amd1突变体。整胚原位杂交实验显示，受精后24 h，在WT斑马鱼胚胎中AMD1主要在头部、眼睛、体节及内胚层区域表达，而在amd1纯合子斑马鱼胚胎中，AMD1的表达明显减弱(图2D)。

图2 斑马鱼amd1突变体的检测结果

2.3 斑马鱼amd1突变体的鉴定结果

琼脂糖凝胶电泳结果显示，3对引物以纯合子DNA为模板扩增后有条带出现，amd1-screen-(3)-5′扩增后无条带出现，故amd1-screen-(3)-5′为最佳鉴定引物(图3A～B)。用此引物来鉴定amd1 F3代斑马鱼胚胎是否为纯合子，随机选择其中16个胚胎与1个WT斑马鱼胚胎提取DNA，PCR扩增后发现，有6个样本无条带(图3C)。为了排除模板的问题，使用amd1-check-5′和amd1-check-3′这对引物对所有模板进行扩增，验证后发现均存在条带(图3D)，表明每个样本的PCR模板均没有问题。进一步将图3D所示PCR样本3、6、8、9等测序，发现所测样本均为2种突变类型的纯合子(图3E)。

图3 amd1纯合子斑马鱼胚胎的筛选与测序结果

3 讨论

CRISPR/Cas9是继ZFN[8]、TALENs[9]等基因编辑技术推出后的第三代基因编辑技术，具有成本低、效率高[10]等优点。通过人工设计的sgRNA来识别目的基因组序列，引导Cas9蛋白酶进行有效切割DNA，最终达到对基因组DNA进行编辑的目的[10]。

研究[5-7]表明，AMD1在癌症发生中起着重要作用，但其在胚胎发育中的作用尚不清楚。本研究使用CRISPR/Cas9技术构建斑马鱼amd1突变体,针对amd1外显子1设计了2个sgRNA靶点序列，通过测序技术验证其有效性。将成年斑马鱼F0代与WT自交得到F1代，通过测序技术发现，F1代斑马鱼有2种突变体。F1代与WT斑马鱼杂交得到F2代，测序筛选出F2代杂合子后，自交得到F3代稳定遗传的斑马鱼amd1突变体。整胚原位杂交实验显示，受精后24 h,AMD1在WT斑马鱼胚胎的头部、眼睛、体节及内胚层区域表达，而在amd1纯合子斑马鱼胚胎中表达明显减弱，说明amd1突变体构建成功。为快速鉴定纯合子，根据2种不同的突变位点，设计4个特异性鉴定引物，使其分别与amd1-check-3′组合成1对引物，使用PCR扩增纯合子和WT DNA模板，琼脂糖凝胶电泳检测后无条带者则为最佳鉴定引物。在F3代斑马鱼胚胎中，随机选取其中16个胚胎与1个WT斑马鱼胚胎提取DNA，用amd1-screen-(3)-5′与amd1-check-3′组合扩增，琼脂糖凝胶电泳检测后发现存在无条带样本，用测序技术验证后均为纯合子，因此鉴定纯合子的最佳引物为amd1-screen-(3)-5′。

综上所述，本研究成功构建斑马鱼amd1突变体，并运用PCR技术设计鉴定纯合子胚胎的引物，使短片段缺失的突变体鉴定变得简单，为筛选突变体提供新思路。本研究不足之处在于未深入研究amd1在胚胎发育中的作用，将在后续工作中进一步开展。