红花黄色素注射液对氟伐他汀在大鼠体内药代动力学的影响

★ 祝婧云 黄福满 梁新丽（.南昌大学第四附属医院 南昌 330003；.江西中医药大学现代中药制剂教育部重点实验室 南昌 330004）

由于生活方式的改变和人口老龄化，我国心脑血管疾病患者人数明显增加。高脂血症是导致动脉粥样硬化进而形成心血管事件的主要因素之一，有效防治血脂异常是预防心血管疾病的重要手段，大量临床研究表明，他汀类药物通过降低低密度脂蛋白以及保护血管内皮、抗炎等作用，可显著降低心脑血管事件的发生率，被临床广泛应用。红花黄色素是从活血化瘀中药红花中提取出来的主要有效成分，为多种水溶性查尔酮成分的混合物［1］。现代临床和药理实验表明红花黄色素具有降血脂、扩张动脉、抑制血小板黏附、抗血小板聚集等作用［2-3］，还能降低胆固醇、甘油三脂、低密度脂蛋白，升高高密度脂蛋白［4］。临床上常用于配合他汀类药物治疗心血管疾病［5-6］。红花黄色素是否影响他汀药物的药代动力学特征值得探讨。本研究采用LC-MS测定大鼠血浆中氟伐他汀药物浓度，考察红花黄色素对氟伐他汀药代动力学的影响。

1 材料

1.1 仪器

Agilent 1290色谱系统（包括二元梯度泵，自动进样器，柱温箱，美国捷伦科技有限公司）；质谱系统 为AB SCIEX Q-TRAP 4500，连PEAKSCIENFIC氮气发生器，工作站为Analyst 1.6.1CF1524R；3-18K 型高速冷冻离心机（德国SIGMA 公司）；DN-24A干式氮吹仪（上海比郎仪器制造有限公司）；IKA genius 3旋涡混合器 (德国 IKA集团)；BS124S型电子分析天平（德国Sartorius公司）

1.2 试药

注射用红花黄色素（山西德元堂药业有限公司，批号：913020091，规格：150 mg/瓶）；氟伐他汀钠胶囊（北京诺华制药有限公司，批号：H20010518，规格：40 mg/粒）；氟伐他汀对照品（中国食品药品检定研究院，批号：100800-201302，含量95.5%）；瑞舒伐他汀对照品（中国食品药品检定研究院，批号：101028-201803，含量98.4%）；甲醇（色谱纯，德国Merck公司）；乙酸（分析纯，国药集团化学试剂有限公司）；水为超纯水。

1.3 动物

SD大鼠，雄性，体重（200～220）g，由江西中医药大学实验动物科技中心提供，许可证号SCXK （赣）2018-0003。标准环境下适应性饲养1周。本研究动物实验方案已获得江西中医药大学实验动物伦理委员会批准。

2 方法

2.1 色谱与质谱条件

色 谱 条 件：ACE Ultracore Super C18柱（2.1 mm× 100.0 mm，2.5 μm），流动相：甲醇-甲酸水（65∶35），流速：0.2 mL/min，柱温：40 ℃，进样量：2 μL。

质谱条件采用负离子电喷雾电离模式（ESI）检测，检测模式为多反应监测（MRM），离子化电压（IS）4.5 kV；离子源温度（TEM）为500 ℃；气帘气（CUR）为10 psi；碰撞气（CAD）Medium；雾化气（GS1）45 psi，辅助加热气 （GS2）50 psi。驻留时间375 msn；碰撞诱导解离（CD）电压均为35 V；用于定量分析的离子反应分别为m/z410.2→m/z345.1（氟伐他汀），m/z450→m/z417.9（内标，瑞舒伐他汀）。

2.2 溶液的配制

2.2.1 对照品储备液的制备精密称取氟伐他汀对照品适量至25 mL 容量瓶中，用甲醇溶解并定容，制成20 µg/mL的氟伐他汀对照品溶液，用甲醇稀释成16.0，8.0，4.0，2.0，1.0，0.5 µg/mL系列浓度对照品储备液。

2.2.2 内标溶液的制备取适量瑞舒伐他汀对照品，分别置于 25 mL 量瓶中，加入甲醇溶解并定容，配制成质量浓度为 50 μg/mL的内标溶液，置于5 ℃冰箱保存，待用。

2.3 血浆样品的处理

取大鼠血浆200 μL，加入内标1 µg/mL瑞舒伐他汀溶液10 µL，涡旋2 min后，加入0.1 mol/L冰醋酸溶液100 µL酸化混匀后加入4.0 mL乙酸乙酯振荡，5 000 r/min离心10 min，取上清液3.8 mL，置于40 ℃下氮气流下吹干，剩余物质加入100 μL 甲醇复溶，经15 000 r/min离心10 min，取2 μL 进样分析。

2.4 方法学考察

2.4.1 专属性考察考察样品出峰处是否有杂质干扰，样品峰与内源性杂质是否完全分离。

2.4.2 标准曲线的制备精密吸取空白血浆200 μL，分别加入氟伐他汀对照品储备液20 µL，使其质量浓度分别为100，200，400，800，1 600，3 200 ng/mL，按“血浆样品处理”项下处理后进样，以氟伐他汀浓度为横坐标，氟伐他汀与内标峰面积为纵坐标，用加权最小二乘法作直线回归。

2.4.3 基质效应精密吸取空白血浆200 μL经提取后，分别加入高、中、低（1 600，400，100 ng/mL）氟伐他汀对照品溶液和内标溶液，进样测定氟伐他汀和内标峰面积为A，相应的等量对照品溶液，进样测得峰面积为B，基质效应ME（%）=A/B×100%

2.4.4 提取回收率实验精密吸取空白血浆200 μL，分别加入高、中、低（1 600，400，100 ng/mL）氟伐他汀对照品溶液10 µL，按“2.3”项下处理并测定，每个浓度平行操作5管，测得的色谱峰面积与空白血浆经提取后加入相应浓度对照品溶液的峰面积比值即为提取回收率。

2.4.5 精密度实验精密吸取空白血浆200 μL，分别加入高、中、低（1 600，400，100 ng/mL）氟伐他汀对照品溶液10 µL，按“2.3”项下处理后进样测定，以1天内3次测定结果计算日内RSD，以1周内5 d测定结果计算日间RSD。

2.4.6 稳定性考察精密吸取空白血浆200 μL，分别加入高、中、低（1 600，400，100 ng/mL）氟伐他汀对照品溶液10 µL，每个浓度平行操作5管，分别在室温下放置6 h后-20 ℃冰箱中冷冻保存15 d、反复冻融3次，按“2.3”项下处理后进样测定，考察在不同条件下保存血浆样品的稳定性。

2.5 给药及血样采集

将12只雄性大鼠随机分为2组，每组6只，分为单药组（氟伐他汀）与联合用药组（氟伐他汀+红花黄色素），给药前大鼠禁食12 h，自由饮水。实验时单药组灌胃给予氟伐他汀8 mg/kg（每1 mL溶液中含氟伐他汀1 mg），联合用药组则在腹腔注射红花黄色素16 mg/kg，5 min后给予氟伐他汀8 mg/kg灌胃，两组分别在给药前及给药后0.166，0.25，0.5，0.75，1，1.5，2，3，4，6，8，12 h眼眶静脉丛取血0.5 mL，置于1.5 mL肝素抗凝管中，4 000 r/min离心10 min，精密吸取上清液1.5 mL EP管中，立即储存于-20 ℃冰箱，备用。

2.6 统计学方法

3 结果

3.1 方法学考察

本法专属性较好，氟伐他汀和内标与血浆中的内源性杂质有较好的分离度，空白血浆中的内源性杂质及其它杂质不干扰样品峰，见图1。氟伐他汀在低、中、高3种浓度水平的平均ME值分别为98.6%、102.1%、97.5%。氟伐他汀在100～3200 ng/mL内线性关系良好，得回归方程Y=38.947X，R2=0.998 8，定量下限为100 ng/mL。高、中、低3个浓度的提取回收率为88.61%，90.46%，85.64%，RSD分别为5.21%，8.20%，4.59%。日内精密度RSD为8.52%，6.54%，7.89%，日间精密度RSD为4.65%，9.02%，6.35%，均符合要求。样本室温放置6 h、-20 ℃冷冻保存15 d、反复冻融3次稳定性均较好，RSD均小于15%。上述方法学结果表明，该方法符合生物样品分析的有关要求。

图1 质谱图

3.2 红花黄色素注射液对氟伐他汀在大鼠体内药代动力学的影响

单用组和联用组所得血药浓度数据结果经DAS 3.3.0药动学软件处理后，主要药动学参数见表1，平均血药浓度-时间曲线见图2。结果表明，与单药组比较，联用组的Cmax、AUC0-t、AUC0-∞均明显减少，CLz/F明显延长，差异有统计学意义（P<0.05或P<0.01），T1/2、Tmax组间变化不明显（P>0.05）。

表1 大鼠单独服用氟伐他汀与合用红花黄色后氟伐他汀的药代动力学参数（ ±s，n=6）

表1 大鼠单独服用氟伐他汀与合用红花黄色后氟伐他汀的药代动力学参数（ ±s，n=6）

注：与单用组比较，*P<0.05，**P<0.01。

药代动力学参数 单药组 联合用药组Cmax/（ng·mL-1） 1 943.224±552.08 788.2619±389.29*Tmax/h 0.6±0.38 0.7±0.24 T1/2/h 1.854 6±0.09 2.303 4±0.71 CLz/（F/L·h-1·kg-1） 3.120 6±0.86 6.754 8±1.03**AUC0-t/（ng·h·L-1） 6 661.79±2 031.523 2 838.375±407.54*AUC0-∞/（ng·h·L-1）6 876.081±2 112.90 3 014.084±437.02*

图2 大鼠单独服用氟伐他汀与合用红花黄色素后氟伐他汀的药-时曲线图

4 讨论

近年来，随着中医药现代化的不断发展，中西医结合已成为治疗疾病的主要手段。合理的中西药联用能增强疗效、减少药物不良反应。反之，则会降低疗效、增加药物不良反应。由于中药成分复杂，中药与西药之间可能存在多种相互作用，中西药合用可能不是中药与西药的简单相加，中西药联用还可能调节药物代谢酶和转运体的表达和功能，进而产生药动学相互作用［7-8］。因此，药代动力学已成为研究中西药相互作用的一个重要途径。

本研究围绕中药红花黄色素对西药氟伐他汀在大鼠体内药代动力学的影响进行了初步的探讨。考虑雌性大鼠荷尔蒙和生理周期的影响，本研究动物选用雄性大鼠。研究结果显示，与单药组相比，联合用药组氟伐他汀的主要药动学参数Cmax、AUC0-t、AUC0-∞均明显减少，CLz/F明显增加，差异有统计学意义，说明红花黄色素可能会减少氟伐他汀的吸收，加快氟伐他汀的清除。提示我们在临床实际工作中应尽量避免同时使用红花黄色素和氟伐他汀，以免降低氟伐他汀的血药浓度，影响氟伐他汀的临床疗效。

P450酶是参与药物代谢的主要酶系，可改变他汀类药物的药代动力学特性，研究表明，CYP2C9是氟伐他汀肝脏代谢的主要代谢酶，氟伐他汀的主要产物M-2、M-5经CYP2C9代谢形成，少量代谢产物M-3由CYP3A4代谢产生［9］。高海珣等［10］研究证明红花黄色素可上调细胞色素P450中的CYP1A1和CYP2C11、抑制CYP1A2 和CYP4A1，但对 CYP2E1、3A1、3A2都没有明显的影响。那么红花黄色素是否会影响CYP2C9和CYP3A4，进而影响氟伐他汀的药代动力学特性。此外，有研究显示有机阴离子转运多肽（OATP）作为最重要的转运蛋白也参与了氟伐他汀的转运，OATP1B1、OATP2B1、OATP1B3均可影响氟伐他汀的体内转运［11-12］，其中OATP1B1转运最为显著，提示氟伐他汀是OATP1B1的底物。因此，红花黄色素对于氟伐他汀药代动力学改变是否与OATP1B有关，尚需进一步研究。