熟地黄配方颗粒和标准汤剂中地黄苷D的含量测定

★ 徐雄飞 王海燕 何清（江西百神药业股份有限公司 江西 宜春 336000）

地黄来源于玄参科植物地黄Rehmannm glutinosaLibosch.的块根，生地黄具有清热凉血、养阴生津的功效，熟地黄则具有够滋阴补血、益精填髓功效。熟地黄配方颗粒由地黄经蒸制、干燥、水煎煮、浓缩干燥、制粒等过程制备而成，而其有效成分之一毛蕊花糖苷经炮制、煎煮易损失，不能很好的体现熟地黄配方颗粒的质量。药理学试验表明地黄苷D具有滋阴、补血及降血糖活性，其药效作用与中医临床传统用药相符合。根据2020版药典熟地黄饮片选择地黄苷D作为熟地黄配方颗粒的含量测定指标，体现中医临床功效和中药传统炮制特色，更好的控制熟地黄配方颗粒的质量。本实验通过对熟地黄标准汤剂和配方颗粒的地黄苷D的含量进行研究，经方法学考察和样品的测定，表明方法可靠，可以用于熟地黄配方颗粒的质量控制。

1 仪器与试药

1.1 仪器

H-Class超高效液相色谱仪（美国Waters公司）；XSE205Du电子分析天平（梅特勒托利多公司）；KQ400DE数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；LGJ-10型真空冷冻干燥机（北京松源华兴科技发展有限公司）；ZLG-10型喷雾干燥机（常州一步干燥设备有限公司）。

1.2 试药

地黄苷D对照品（批号7433，纯度100%，上海诗丹德）；地黄配方颗粒（批号20190701，江西百神药业股份有限公司）；甲醇（色谱纯，美国天地有限公司）；磷酸（分析纯，西陇科学股份有限公司）；水为超纯水。

2 实验方法与结果

2.1 色谱条件

色 谱 柱：ACQUITY UPLC BEH C18（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）；流动相：甲醇-0.1%磷酸溶液（5∶95)；流速：0.2 mL/min；柱温：20 ℃；检测波长：203 nm。理论板数按地黄苷D峰计算应不低于5 000。

2.2 溶液的制备

对照品溶液的制备：取地黄苷D对照品适量，精密称定，加流动相制成每1 mL含70 μg的溶液，即得。

供试品溶液的制备：取装量差异项下的本品，混匀，取适量，研细，取约1 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加流动相25 mL，称定重量，超声处理（功率250 W，频率40 kHz）30 min，放冷，再称定重量，用流动相补足减失的重量，摇匀，滤过，即得。

2.3 标准汤剂制备

称取熟地黄150 g，煎煮2次，第1次加水9倍量，浸泡30 min，煎煮60 min，滤过，滤液备用；第2次加水7倍量，煎煮40 min，滤过，合并两次滤液，混匀；减压浓缩至饮片投料量：浓缩液体积约为1∶2（g∶mL）的浸膏，冷冻干燥，即得。

2.4 方法学考察

2.4.1 系统适用性与专属性试验分别精密吸取对照品溶液、供试品溶液、阴性样品溶液各2 μL，注入超高效液相色谱仪，按“2.1”项下色谱条件进样测定，如图1。结果显示，供试品溶液中地黄苷D和相邻色谱峰分离度为1.94；且阴性样品在与对照品溶液色谱峰相应的保留时间无色谱峰，不受辅料、溶剂等因素的干扰，表明该方法专属性良好。

图1 熟地黄配方颗粒含量专属性试验

2.4.2 线性关系考察取地黄苷D对照品适量，精密称定，加25%甲醇制成每l mL含350 μg的溶液，摇匀。分别精密量取1.0，2.0，4.0，6.0，10，30 mL置于50 mL棕色瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀，制成浓度分别7.0，14.0，28.0，42.0，70.0，210 μg/mL的标准溶液，分别精密量取上述溶液2 μL注入液相色谱仪；以其峰面积为纵坐标（Y），进样量为横坐标（X），得线性回归方程Y=477 220X-1 350.2（r=0.999 9），结果表明地黄苷D在0.014 3～0.717 μg范围内线性关系良好。

2.4.3 精密度试验取本品（批号20190701）约1 g，精密称定，按“2.2”项制备供试品溶液，精密吸取2 μL，按2.2项下色谱条件测定峰面积，连续进样6次，结果地黄苷D峰面积的RSD为0.96%，表明本方法精密度良好。

2.4.4 稳定性试验取本品（批号20190701），研细，取约1 g，精密称定，按“2.2”项制备供试品溶液，分别在制备后放置0，2，4，8，12，24 h进样测定，结果地黄苷D峰面积的RSD为1.30%（n=6），供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.4.5 重现性试验取本品（批号20190701），研细，取约1 g（共6份），精密称定，按“2.2”项制备供试品溶液，精密吸取2 μL，按“2.1项色谱条件测定峰面积，平均含量为1.18 mg/g，RSD=0.98%，表明本法重现性良好。

2.4.6 准确度试验精密称取地黄苷D（批号7433，纯度100%）11.66 mg，置20 mL量瓶中，加适量25%甲醇超声处理使溶解，取出，放冷，加25%甲醇稀释至刻度，摇匀，得浓度为0.583 mg/mL地黄苷D对照品贮备溶液。分别精密量取1 mL（共6份），置锥形瓶中，蒸干。取本品（批号20190701），研细，取约0.5 g（共6份），精密称定，分置上述具塞锥形瓶中，分别精密加流动相25 mL，称定重量，超声处理（功率250 W，频率40 kHz）30 min，放冷，再称定重量，用地黄苷D补足减失的重量，摇匀，滤过，精密吸取续滤液2 μL，注入液相色谱仪，测定，即得。结果见表1，地黄配方颗粒（批号20190701）中地黄苷D的含量为1.176 mg/g。结果，地黄苷D平均回收率为98.70%，RSD为1.65%，表明本方法准确度较好。

表1 地黄苷D准确度试验结果（n=6）

2.5 样品含量测定

取3批不同批号的样品适量，研细，取约1 g，精密称定，按“2.2”项制备供试品溶液，精密吸取2 μL，按“2.1”项色谱条件测定3批熟地黄配方颗粒样品中地黄苷D的含量，结果见表2。

表2 3批熟地黄配方颗粒中地黄苷D含量测定结果 mg/g

2.6 标准汤剂含量及转移率

取3批不同的熟地黄饮片（批号20190601P、20191201P、20200101P）按照2020版《中国药典》一部熟地黄饮片含量测定项下方法分别测定地黄苷D含量。取以上3批饮片按“2.3”项下方法制备标准汤剂样品，分别得到干膏粉99.24，98.60，107.26 g。取上述标准汤剂干膏粉约1g，精密称定，按“2.2”项制备供试品溶液，精密吸取2 μL，按“2.1”项色谱条件测定3批标准汤剂中地黄苷D的含量并计算转移率，结果见表3。通过3批标准汤剂含量转移实验，表明地黄苷D经煎煮可从饮片转移到配方颗粒中，且转移率达到80%，表明饮片和配方颗粒的地黄苷D的含量可以保持质量一致性。

表3 3批熟地黄饮片和标准汤剂地黄苷D含量及物质转移测定结果

2.7 喷雾干燥对含量及转移率的影响

取3批不同的熟地黄饮片（批号20190601P、20191201P、20200101P）各15 kg，按“2.3”项方法制备浓缩液至相对密度1.08～1.10（60℃）的浸膏，采用喷雾干燥进行干燥。喷雾干燥参数为：进风温度165～170 ℃，雾化器转速100 Hz；进液物料温度：70～75 ℃；进液速度：30 r/min；出风温度：70～75 ℃。分别得到干膏粉10.29，10.53，10.83 kg，取上述干膏粉约1 g，精密称定，按“2.2”项制备供试品溶液，精密吸取2 μL，按“2.1”项下色谱条件测定峰面积，测定3批标准汤剂中地黄苷的含量转移数据，结果见表4。通过3批喷雾干燥含量转移实验，表明喷雾干燥对地黄苷D含量基本无影响，表明采用喷雾干燥和标准汤剂的地黄苷D的含量可以保持质量一致性。

表4 3批喷雾干燥熟地黄干膏粉地黄苷D含量及物质转移测定结果

3 讨论

在样品提取条件的筛选试验中，分别采用本方法流动相、20%甲醇、50%甲醇、纯甲醇超声提取，结果表明采用本实验流动相的结果最高，20%甲醇、50%甲醇的结果稍低，并且用流动相做溶剂可避免效应，故采用流动相制备供试品溶液。同时还考察了加热回流提取和超声提取2种方法的效果，结果显示，2种提取方法含量结果相近，超声提取更简便，故最终选择超声提取。以甲醇-0.1%磷酸溶液（5∶95）作为提取溶剂时，考察了超声提取15，30，45 min对提取率的影响，结果超声提取30 min时，地黄苷D基本提取完全，故选择超声提取30 min处理供试品。

因喷雾干燥具有干燥速度快、物料受热时间短、生产工序简单、操作简便、可控性好、产品质地均匀、溶解性好等特点。因此按标准汤剂的加水量、煎煮时间、煎煮次数进行提取浓缩，浸膏干燥由冷冻干燥改为喷雾干燥进行试验比较，考察喷雾干燥工艺对地黄苷D的影响。结果喷雾干燥的平均出膏率为70.1%，与平均含量转移率89.7%基本一致，表明地黄苷D对热比较稳定，喷雾干燥的过程对地黄苷D含量基本无影响，熟地黄配方颗粒与标准汤剂具有一致性且质量稳定可控。放大生产后含量转移率和出膏率有所提高，主要是一煎的出膏率和含量有所提高，因为批量加大投料后煮沸所需时间增加了约15 min。按照每1 g配方颗粒相当于饮片1.3 g，结合标准汤剂中平均含量转移率与平均出膏率计算，暂定本品按每1 g含地黄苷D（C27H42O20）应为不低于0.55 mg。