响应面法优化黄山石耳多糖提取工艺
2022-08-19蔡为荣丁伯乐张冬冬
苏 超，蔡为荣，丁伯乐，张冬冬，徐 迪，张 爽
(1.芜湖职业技术学院芜湖市生命健康工程技术研究中心，安徽芜湖 241000；2.安徽工程大学生物与食品工程学院，安徽芜湖 241000)
0 引言
石耳(UmbilicariaEsculenta)是地衣门石耳科植物，又名石木耳、岩菇、石壁花，因其形状似耳又生长在山间阴暗潮湿的石缝中而得名，主要分布在安徽、浙江、陕西、东北长白山等海拔较高的地区[1-2].据《本草纲目》记载，石耳“性甘平无毒，能明目益精”，具有养阴润肺、清热解毒和凉血止血的作用[3-4].近年来的研究表明，石耳等多糖具有免疫调节、抗病毒及抗癌、降血糖、抗氧化、抗凝血、抗癌等生理活性作用[5-11].石耳多糖生理活性及开发利用受到众多食品、药品、保健品等科技工作者的关注[8-11].
报道的石耳多糖提取方法主要是基于单因素试验和正交试验设计方法上的水提醇沉法、微波辅助提取法、超声波辅助提取法等[12-15].响应面分析法(RSM)系采用多元二次回归方程作为函数估计的的工具，来拟合多因子实验中的因素和响应值之间的函数关系，通过对数学模型的方差分析寻求最佳工艺参数的一种有效方法[16].相比过去广为使用的“正交试验设计”，它具有试验周期短，计算简便、快捷等优点.本研究选择响应面分析法优化石耳多糖的提取工艺，旨在为石耳多糖的工业生产和深加工提供有益参考.
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
石耳UmbilicariaEsculenta(采自于安徽黄山地区)；丙酮、苯酚、无水乙醇(分析纯，南京试剂有限公司)；葡萄糖、浓硫酸(分析纯，国药集团化学试剂有限公司)
1.2 主要仪器与设备
UVmini-1280紫外可见分光光度计(日本岛津)；RE-85Z旋转蒸发器(上海青浦沪西仪器厂)；HH-4数显恒温水浴锅(常州天瑞仪器有限公司)；SHB循环水式真空泵(郑州市上街华科仪器厂)；真空冷冻干燥机(美国SIM公司)；L-550离心机(湘仪离心机有限公司)
1.3 实验方法
1.3.1 黄山石耳多糖的提取 将黄山石耳于60 ℃烘干，用粉碎机将其粉碎后过100目筛保存备用.称取石耳粉末，按单因素实验或响应面设计(表1)提取条件提取石耳粗多糖.提取液通过抽滤、浓缩后制取粗多糖浓缩液，然后加入4倍体积的无水乙醇置于冰箱中24 h进行沉淀.沉淀完成后的溶液经5 000 rpm离心10 min后，对所得沉淀物用少量无水乙醇、丙酮洗涤、无水乙醚2次，加水复溶后用旋转蒸发除去酒精，备用.
1.3.2 黄山石耳多糖含量的测定 采用改良苯酚-硫酸法[17]测定多糖的含量，用紫外可见分光光度计测定波长在490 nm处的吸光度，绘制标准曲线，得
y=8.25x-0.0113,R2=0.998 8
(1)
其中，y为490 nm下的吸光度值，x为葡萄糖的质量浓度(mg/ml).
黄山石耳粗多糖得率为：
Y=(m/W)×100%
(2)
其中，m为多糖质量，W为原料质量.
1.3.3 黄山石耳多糖提取的单因素实验
(1)准确称取2.000 0 g的黄山石耳干粉，固定提取的时间为3 h，料液比为1∶40(g/ml)，选取提取温度(55、65、75、85、95) ℃，考察提取温度对黄山石耳多糖提取率的影响.
(2)同上，准确称取黄山石耳干粉，固定提取的时间为3 h，提取温度为75 ℃，选取料液比(1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60)g/ml，考察料液比对黄山石耳多糖提取率的影响.
(3)同上，准确称取黄山石耳干粉，固定提取温度为75 ℃，料液比为1∶40，考察提取时间(1、2、3、4、5)h对黄山石耳多糖提取率的影响.每组试验重复3次，取平均值.
1.3.4 响应面优化试验 采用Box-Behnken响应面分析试验，选择提取温度(Z1)、提取时间(Z2)、料液比(Z3)作为自变量，黄山石耳多糖得率(Y)为响应值，响应面试验设计方案如表1.
2 结果与讨论
2.1 单因素试验结果
2.1.1 提取温度对黄山石耳多糖得率的影响 提取温度对多糖得率的变化关系如图1.从中可见，在55-85 ℃范围内，黄山石耳多糖的得率随着提取温度的上升呈现不断增大的的趋势.当提取温度为85 ℃的时候，黄山石耳多糖的得率达到最大(15.8%)，随后多糖得率开始下降.这可能是由于提取温度高于85 ℃时，温度的增加可能会破坏多糖的高级结构，所以选取适宜的提取温度为85 ℃[18].
图1 提取温度对黄山石耳多糖得率的影响Fig.1 Effect of extraction temperature on polysaccharide extraction rate
2.1.2 提取时间对黄山石耳多糖得率的影响 在浸提时间2 h以内(图2)，黄山石耳多糖的得率呈缓慢上升的状态.在2-3 h范围内，黄山石耳多糖的提取率大幅度上升，原因是随着提取时间的增加，多糖大量从细胞壁中分解出来.在3-5 h范围内，曲线呈现下降状态，这可能是由于提取时间过长，超出最适提取时间后，其他非多糖成分会随着提取时间的延长而溶出，使部分多糖与非多糖成分结合，而呈得率下降[19-20].因此选择适宜的提取时间为3 h.
图2 提取时间对黄山石耳多糖得率的影响Fig.2 Effect of extraction time on polysaccharide extraction rate
2.1.3 料液比对黄山石耳多糖得率的影响 料液比对多糖得率的影响如图3.在料液比1∶20(g/ml)-1∶40(g/ml)范围内，黄山石耳多糖的得率随着料液比的增大呈现不断增加的的趋势.在料液比1∶40(g/ml)-1∶60(g/ml)范围内，曲线呈现下降状态.料液比1∶40(g/ml)达最高，说明多糖已经达到最大溶解状态.考虑简化后续的实验操作和降低能耗，故料液比选择为1∶40(g/ml).
图3 料液比对黄山石耳多糖得率的影响Fig.3 Effect of solid-liquid ratio on polysaccharide extraction rate
2.2 响应面结果分析
2.2.2 响应面回归模型的建立与拟合 通过Design-Expert12对表2数据进行回归拟合，得到得到回归方程如下：
Y=18.648+2.423 75X1+0.923 75X2-0.605X3+0.14X1X2-0.657 5X1X3-0.637 5X2X3-3.236 5X12-2.161 5X22-2.559X32
2.2.3 响应面与等高线图分析 固定回归方程的料液比、提取时间、提取温度因素，分别获得相应的另二个因素多糖得率影响曲面图与等高线图(图4～图6).由图4～图6中的响应面呈均抛物曲面，直观地反映了两两因素对响应值的影响；等高线图可以看出圆点附件有极值点.比较图4、图5和图6可知，X1和X3两因素的曲线较陡，X1和X2两因素的影响次之，X2和X3两因素影响的曲线相对变化较小.
图4 Y=f(X1,X2)的响应面和等高线图(X3=0)Fig.4 Response surface and contour plot of Y=f(X1,X2)，(X3=0)
图5 Y=f(X1,X3)的响应面和等高线图(X2=0)Fig.5 Response surface and contour plot of Y=f(X1,X3)，(X2=0)
图6 Y=f(X2,X3)的响应面和等高线图(X1=0)Fig.6 Response surface and contour plot of Y=f(X2,X3)，(X1=0)
2.2.4 确定最佳点与验证 为了进一步确证最佳点的值,对回归方程取一阶偏导数等于零并整理得
2.423 75-6.473X1+0.14X2-0.657 5X3=0
(3)
0.923 75+0.14X1-4.323X2-0.637 5X3=0
(4)
-0.605-0.657 5X1-0.637 5X2-5.118X3=0
(5)
求解方程组(3)、(4)、(5)，得X1=0.400，X2=0.256，X3=-0.202，代入原变换，求解得黄山石耳多糖最优提取条件为提取温度89 ℃，提取时间3.26 h，料液比1∶37.98 (g/ml).考虑到提取工艺的可操作性和可行性，将最佳工艺条件修正为提取温度89 ℃，提取时间3.25 h，料液比1∶38(g/ml).
为验证BBD的可靠性，采用上述最优提取条件进行石耳多糖提取，通过三次平行测定，测得黄山石耳多糖的得率均值为19.18%，该得率与模型预测最大值19.31%接近，两者相对误差小于1%，说明本响应面试验优化黄山石耳多糖的提取工艺是可行的.
3 结论
采用水提醇沉法提取黄山石耳多糖和改良苯酚-硫酸法测量其含量，通过单因素实验选取提取时间、液固比和提取温度作为优化石耳多糖得率的3个因素，通过Box-Behnken实验和响应面优化获得最优提取工艺为提取温度89 ℃，提取时间3.25 h，料液比1∶38(g/ml)，得率为19.31%.在此最优工艺条件下进行验证实验，实测值为19.18%，误差为0.7%，响应面模型拟合成功，为黄山石耳多糖的提取提供了有益参考.
