三种葡萄醋对高脂饮食大鼠血脂水平的影响

陈璐，石俊，赵昊，张晓蒙，王妍凌，张晶晶，杨帆，卢灏泽，张凤杰，金玮鋆，于佳俊，薛洁*

1(新疆农业大学 食品科学与药学学院，新疆 乌鲁木齐，830052)2(中国食品发酵工业研究院有限公司，北京，100015) 3(西藏农牧学院 食品科学学院，西藏 林芝，860000)4(酒类品质与安全国际联合研究中心，北京，100015)

葡萄醋是以葡萄、葡萄汁等为原料，经酒精和醋酸双重发酵而成，与粮食醋相比，葡萄醋色美味佳又兼具保健功能，其成分与葡萄酒相似，含有丰富的有机酸、氨基酸、多酚类物质、矿物质等有益成分[1]。葡萄醋中的有机酸能促进新陈代谢,加快肌肉中乳酸的分解，从而消除疲劳[2-3]；葡萄醋中的氨基酸等物质能刺激神经中枢，促使胃分泌更多的胃液，从而促进消化；葡萄醋还具有利尿、降血糖、降血脂、抗氧化、延缓衰老的功能[4-5]；另外，它还能够破坏亚硝酸盐，抑制碱性细菌的繁殖，起到防癌和抗癌的效果[6]。

由于高蛋白、高脂肪食物摄入量增加，高血脂症患病人数也越来越多。高脂血症是指血液中的一种或几种脂质水平异常。目前，临床上常采用药物治疗和饮食干预的方法控制和降低血脂水平。药物治疗所用的药物，如羟甲基戊二单酰辅酶A还原酶抑制剂、烟酸类等，均存在一定的副作用，如肝脏功能损害、胃肠功能紊乱等[7-9]。饮食控制虽然能够在一定程度上起到调节机体内脂质代谢的作用，但长期来看控制效果欠佳。相比之下，食用降血脂功能性食品可能是长期控制血脂更理想的方法。本研究以葡萄醋为研究对象，以健康大鼠作为试验模型，研究葡萄醋对大鼠血液、肝脏等健康指标的调节作用，探讨葡萄醋的作用机理，为后续深入探索葡萄醋与机体健康的关系提供坚实基础，为消费者选择葡萄醋提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

实验动物为SPF级KM雄性大鼠120只，体质量(30±2) g，购于斯贝福(北京)生物技术有限公司,动物许可证号为SCXK(京)2019-0010。饲养环境为每天12 h光照、12 h黑暗，温度为(25±1) ℃，相对湿度为60%，自由饮水和进食，无特定病原体。

所有动物都被保存在无病原体的环境中，并临时喂食。动物的护理和使用程序得到了北京医院伦理委员会的批准，并遵守所有适用的有关动物伦理使用的机构和政府法规。

1.1.1 饲料与药物

普通饲料，郑州大学实验动物中心；辛伐他汀片,石药集团欧意药业有限公司；胆固醇，天津原四通化工厂；胆酸钠，北京奥博星生物技术有限公司；吐温-80，河南亚统食品原料有限公司；丙二醇，武汉胜天宇生物科技有限公司；猪油，四川省青川县川珍实业有限公司。

脂肪乳剂配方：20 g猪油、10 g胆酸钠、20 g胆固醇于60 ℃水浴下混合均匀制成油相。称取30 g蔗糖，于60 ℃水浴下溶于30 mL蒸馏水制成水相。量取20 mL吐温-80作为调和剂，20 mL 1，2-丙二醇作为表面活性剂，将油相、水相、调和剂以及表面活性剂于60 ℃水浴下混溶，搅拌至乳黄色。再使用研钵将乳黄色液体研至乳白色，制成乳剂。配制好后，冰箱冷冻储藏。

1.1.2 实验样品

样品A：葡萄醋(纯葡萄汁发酵)、样品B：葡萄醋[V(葡萄汁)∶V(药食同源产品)=1∶1发酵]、样品C：市售葡萄醋。其中样品A和样品B均由中国食品发酵工业研究院酿造；样品B添加山楂、乌梅、陈皮、决明子、紫苏、薄荷、茯苓中药成分汁液。

总胆固醇(total cholesterol，TC)试剂盒、甘油三酯(triglyceride，TG)试剂盒、高密度脂蛋白胆固醇(high density lipoprotein cholesterol，HDL-C)试剂盒、低密度脂蛋白胆固醇(low density lipoprotein cholesterol，LDL-C)试剂盒，南京建成生物工程研究所；基因组DNA提取试剂盒，Omega Bio Tek公司；高效RIPA裂解液，单去污剂裂解液(phenylmethylsulfonyl fluoride, PMSF)，北京索莱宝科技有限公司；0.01 mol/L磷酸缓冲盐溶液(phosphate buffered saline，PBS)(pH 7.0～7.2)，通用型组织固定液(中性)，武汉赛维尔生物科技有限公司。

1.2 仪器与设备

LDZX 50KBS高压灭菌锅，上海申安医疗器械厂；BG subMIDI多用途水平电泳仪、BG Power600 h电泳仪电源，上海珂淮仪器有限公司；全波段酶标仪，美国BioTek公司；BC C57 PCR仪、Tanon1600凝胶成像系统，上海天能科技有限公司；高速冷冻离心机，美国BECKMAN COULTER公司。

1.3 实验方法

1.3.1 葡萄醋生产工艺流程

样品A制备流程：

酿酒葡萄→除梗压榨→葡萄醪液→酒精发酵→过滤→调整酒精度(6%～6.5%)→醋酸发酵(34 ℃)→澄清过滤→葡萄原醋

样品B制备流程：

酿酒葡萄→除梗压榨→葡萄醪液→酒精发酵→过滤→调整酒精度(6%～6.5%)→加入药食同源产品汁液→醋酸发酵(34 ℃)→澄清过滤→葡萄原醋

1.3.2 药食同源产品汁液的制备方法

称量药材(乌梅1.5%、山楂1%，陈皮0.75%、紫苏0.1%、决明子0.1%、薄荷0.1%、茯苓0.1%,均为质量分数)，加入蒸馏水，95 ℃浸提60 min，浸提完成过滤，再次加蒸馏水进行二次浸提，过滤备用。

1.3.3 大鼠分组及灌胃

120只KM雄性大鼠适应性喂养1周后，按随机数字表法分为12组(n=10)，分别为对照组、模型对照组、阳性对照组、样品A高剂量组、样品A中剂量组、样品A低剂量组、样品B高剂量组、样品B中剂量组、样品B低剂量组、样品C高剂量组、样品C中剂量组、样品C低剂量组。除对照组以普通饲料喂养外，其余各组均在普通饲料喂养基础上以脂肪乳剂灌胃造模，以6 mL/(kg·d)计，正常对照组每日以等量生理盐水灌胃1次，共喂养4周后取各组动物血清检测TC、TG、LDL-C、HDL-C，判断是否建模成功。

4周后，除对照组以普通饲料喂养外，其余各组均在普通饲料喂养基础上以脂肪乳剂灌胃造模，以6 mL/(kg·d)计，正常对照组每日以等量生理盐水在上午9点灌胃1次。阳性组、样品低剂量组、中剂量及高剂量组每天分别以4、1.25、2.5、5 mL/(kg·d)相应药物剂量在下午4点灌胃1次，对照组及模型组每天以等量生理盐水灌胃。于8周末取动物样本。检测血清TC、TG、LDL-C、HDL-C、载脂蛋白A1(apolipoprotein A1, ApoA1)及载脂蛋白B(apolipoprotein B, ApoB)含量，并制作肝脏病理切片观察组织病理变化。

1.3.4 样品收集

在灌胃结束后，所有大鼠禁食12 h但不禁水，依次将大鼠移至无菌间用戊巴比妥钠将大鼠麻醉，采用眼眶取血法收集血液样本于离心管中， 3 000 r/min离心15 min，取无溶血血清用于相应指标测定；配合颈椎脱臼法将大鼠处死后，解剖取出肝脏，用冷生理盐水冲洗血渍，滤纸吸干后称重，选取肝脏左叶同一部位组织用通用型组织固定液(中性)固定，剩下肝脏组织置于离心管中放入液氮速冻，-80 ℃保存备用。

1.3.5 肝组织匀浆制备

取大鼠肝脏，每个样品0.1 g，用经过预冷的PBS洗涤组织，用消毒后的剪刀将组织剪成小块放入匀浆器并加2 mL新鲜裂解缓冲液，低温研磨。将研磨后的匀浆放入离心管，4 ℃、3 000 r/min离心15 min，取上清液用于组织蛋白、谷胱甘肽过氧化酶3、总超氧化物歧化酶和过氧化氢酶相应指标的检测，操作方法及步骤按照相应试剂盒说明书进行。

1.3.6 检测指标

1.3.6.1 体质量增长率和肝脏系数

喂养期间每周称量体质量1次，记录并计算每组平均体质量；解剖大鼠后取肝脏，冲洗后称量质量，按公式(1)计算肝脏指数：

(1)

1.3.6.2 血清相关指标测定

将离心后的大鼠血清样本，按照试剂盒说明书操作测定血清中TC、TG、HDL-C、LDL-C等指标，每个指标平行测定3次。

1.3.6.3 肝脏病理切片制作

取出固定后的肝脏组织，用石蜡包埋做冷冻切片，接着用苏木精-伊红染色，在光学显微镜下观察肝组织病理切片的形态学变化，具体方法参照文献[10]。

1.3.7 统计分析

运用Qiime 1.9.1计算相应指数；运用SPSS 17.0分析数据，结合单因素方差及显著性进行分析，数据均采用平均值±标准差表示，P<0.05为差异显著；数据分析方法：t检验。

2 结果与分析

2.1 试验高脂模型建立结果分析

血清总胆固醇或甘油三酯异常升高时，临床分别诊断为“高胆固醇血症”和“高甘油三酯血症”，当两项指标均异常升高时，诊断为“混合型高脂血症”。混合型高脂血症是临床上较为普遍，且存在高危因素较多的一种高脂血症类型[11-12]。

HDL-C被称为好脂蛋白、好胆固醇，有利于血脂降低、软化血管[13]。其可将胆固醇运输到血管之外，运送至肝脏，在肝脏内转换化为其他物质或能量进行代谢，从而达到清理血管的作用，不会形成血管黏稠度过高或者血管粥样硬化等情况。LDL-C被称为坏胆固醇，它可以运载胆固醇进入外围组织细胞，可携带胆固醇存积在动脉壁上，积累后将引起动脉硬化[14-16]。

试剂盒检测造模4周后的大鼠血清中TC、TG、HDL-C、LDL-C的含量见表1。模型组与对照组对比，模型组大鼠血清中TC、TG含量均极显著升高(P< 0.01)，造模成功。这也说明，较长时间的高脂肪、高蛋白的饮食会引起机体内血清中的胆固醇与甘油三酯含量均升高，致使混合型高脂血症的发生，达到混合型高脂血症的判定标准，这也为下一步实验的顺利进行奠定了基础。

2.2 不同样品灌胃后对大鼠体质量的影响

体质量可以直观反映动物状态、代谢水平，可作为实验过程中调整实验方案的有力证据。如图1所示。

a-样品A；b-样品B；c-样品C图1 各组大鼠每周体质量变化曲线Fig.1 Weekly weight gain line chart of each group of rats

在通过饲喂样品干预4周后，大鼠体质量见表2：相对于模型组，3种样品中各组大鼠体质量均有不同程度的降低，其中高、中剂量组体质量均有显著降低(P<0.05)；相对于对照组，除阳性组，其他组大鼠体质量均显著增长(P<0.05)。其中A、B样品大鼠在第5周～第7周普遍出现体质量降低幅度较大情况，结合平时饲养情况，这可能与样品发挥减脂作用及食欲有关，在此期间这几组大鼠食欲均有降低的情况。研究表明，多酚类物质可能参与中枢神经系统的食欲控制，通过5-羟色胺、组胺、多巴胺及其受体控制食物的冲动和饱腹感[17]。本研究中各葡萄醋样品对大鼠体质量均有不同程度的控制作用。

表2 第8周各组大鼠体质量Table 2 Final body weight of mice in each group

2.3 不同样品灌胃后对大鼠血脂的影响

葡萄酒能增加HDL-C和载脂蛋白水平，作为“血管清道夫”，HDL-C能够摄取血管壁内膜底层沉浸下来的LDL-C、TC、TG等有害物质，且使胆固醇构成从细胞膜流向血浆脂蛋白的浓度梯度，使其移至肝脏并分解代谢出体外，减少血浆HDL中游离胆固醇的浓度，对心血管疾病具有保护作用[18-20]。本研究比较了不同样品灌胃后对大鼠血脂功能指标的影响，结果如表3所示。与模型组相比，样品各组TC与TG均有降低。单就TC而言，样品B高剂量组和样品C高剂量组与模型组相比显著降低(P<0.05)；就TG而言，样品B高、中剂量组与模型组相比显著降低(P<0.05)；就HDL-C而言，样品各组有增高趋势，样品组中只有样品B高剂量组与模型组差异性显著(P<0.05)；对于LDL-C而言，样品各组均有降低，样品B各组与模型组差异显著(P<0.05)。

综上，样品B对血脂各指标影响程度相对于其他样品较为明显，说明中药葡萄醋中的中药成分对血脂有改善作用；对于本实验采用的灌胃剂量，样品C中、低剂量组对于血脂影响差异不明显，样品B高、低剂量组对于血脂影响不明显。长期饮用本实验中的中药葡萄醋可预防血脂沉积、动脉硬化、管腔变窄，以及缺血性心血管疾病，因此各组大鼠血脂中HDL-C升高、LDL-C指标显著降低再次证明了葡萄醋对心血管等具有保护作用。

表3 第8周各组大鼠血清TC、TG、HDL-C、LDL-C含量 单位：mmol/L

2.4 不同样品灌胃后对大鼠血清载脂蛋白的影响

血清ApoA作用和HDL-C相同，也是组成HDL-C的成分，它可以抑制动脉硬化的发生，导致冠心病、脑血栓、下肢动脉硬化发病率下降[21-22]。ApoB也由肝脏合成，是LDL-C的主要结构蛋白，约占LDL-C总蛋白含量的97%，ApoB的测定可直接反映LDL-C的水平[23]。

如图2所示，ApoA1、ApoB与HDL-C、LDL-C数据相呼应，但与模型组对比，样品各组差异均不显著。3种样品中，样品B对于两项指标改善幅度最大，样品A与样品C基本无差异。通过ApoA1及ApoB指标的变化可以说明，各组样品对血脂均有改善作用，依旧可以证明葡萄醋对心血管病具有保护作用。

1#-对照组；2#-模型组；3#-阳性组；4#-样品A高剂量组；5#-样品A中剂量组；6#-样品A低剂量组；7#-样品B高剂量组；8#-样品B中剂量组；9#-样品B低剂量组；10#-样品C高剂量组；11#-样品C中剂量组；12#-样品C低剂量组(下同)a-ApoA1；b-ApoB图2 各组大鼠血清ApoA1和ApoB水平Fig.2 Effects of serum ApoA1 and ApoB levels in each group

2.5 不同样品灌胃后对大鼠肝脏系数及组织病理学观察

肝脏系数因其敏感度较高是毒理学中常用指标[24]。当肝脏系数增大时，可能出现肝脏充血、水肿或增生肥大等情况；当肝脏系数减小时，表示肝脏萎缩或其他退行性病变[25]。本研究分析了不同样品灌胃后对大鼠肝脏系数的影响，如图3所示，与模型组相比，阳性组大鼠差异显著(P<0.05)；其他组差异不显著；样品组大鼠肝脏质量及肝脏系数有不同程度的降低，但降低规律并不与样品及剂量高低相关联。

a-肝脏系数；b-肝脏质量图3 不同组别大鼠肝脏系数及肝脏质量Fig.3 Liver coefficients and liver weight of each group

图4是各组大鼠肝脏组织的病理学切片显微观察结果，对照组大鼠肝细胞排列整齐，可见明显的细胞核，胞浆着色较为均匀，未见脂肪变性。模型组肝细胞排列松散，肝细胞排列混乱且有肿大，细胞间隙和细胞内可见许多大小不等的空泡，中央静脉周围病变比较明显，并呈弥漫性重度脂肪变性而导致轻微的脂肪肝。样品A、C的中、低剂量组肝细胞排列也较为整齐，肝细胞较正常稍有肿大的现象，肝细胞间隙也可见少量脂肪滴而形成的空泡，但脂变肝细胞数目较模型组明显减少；样品B各量及样品A、C高剂量组肝细胞排列较整齐，接近于正常，基本上没有脂肪滴空泡，肝细胞基本恢复正常。综合分析得知，样品B各组及样品A、C的高剂量组对大鼠肝脏有不同程度的降脂功能。

图4 肝脏病理组织学观察Fig.4 Histopathology of liver tissues from rats in different groups

3 结论

本实验结果表明，不同样品灌胃后大鼠的体质量均有不同程度的降低，其中A、B样品大鼠在第5周～第7周体质量降低幅度较大；通过对大鼠血脂的检测可以看出3种样品均有降血脂的作用，其中样品B效果更加明显；通过对大鼠血清载脂蛋白的检测可以发现，样品各组ApoA1指标升高、ApoB指标降低，其中样品B对于ApoA1、ApoB两项指标改善幅度最大；不同样品灌胃后各组大鼠肝脏质量及肝脏系数均有降低，但降低规律并不与样品及剂量高低相关联；由肝脏切片可见，与模型组相比样品B各剂量及样品A、C高剂量组肝细胞基本恢复正常，其他各组肝细胞均有不同程度的损伤。摄入葡萄醋后，机体内部脂质含量降低，分解脂质能力增强，由此可见葡萄醋对机体摄入脂质引起的油腻感有控制作用，同时也说明长期适量摄入葡萄醋对健康大鼠的血脂水平有明显改善，以及能有效预防心血管病。综合各项指标来看，3种样品中加了药食同源产品发酵的葡萄醋预防心血管病的作用最明显。