线粒体移植在心肌缺血损伤治疗中的研究

陈航，胡琴丰，林丽，刘建文，陈康辉，陈昭阳†

①福建医科大学附属协和医院，福建省心血管中心，福州 350001；②复旦大学 生物医学研究院，上海 200032

1890年Altmann首次发现线粒体，它是位于细胞质中的一种细胞器。细胞所需能量的主要载体三磷酸腺苷(ATP)大部分产生于线粒体，所以线粒体通常被称为细胞的动力工厂[1]。然而，在高效制造ATP的同时，线粒体也会产生少量可控的含氧活性化学反应性物质，即活性氧簇(ROS)，因此被称为细胞的“核电站”。当线粒体受损时，ROS的产生会增多，并对受损线粒体和周围线粒体造成伤害，从而导致细胞凋亡和坏死。由于受损的线粒体是导致细胞死亡的重要因素，线粒体对维持生命至关重要。

理论上线粒体曾经是拥有呼吸能力而后被细胞吞噬并利用其呼吸功能的古细菌。这一理论的证据在于线粒体有两个脂质膜和自己的环状DNA[2]。随着生命的进化，细胞变得更加依赖线粒体来提供能量，甚至将编码关键线粒体蛋白的基因整合到核DNA中。线粒体是母系遗传的[3]，这意味着每个后代的线粒体DNA(mtDNA)将与其母体的相同。因此，使用母体线粒体追踪家族谱系，也涉及mtDNA突变和疾病的母系遗传。为了避免mtDNA突变的遗传，科学家已尝试在受精卵中进行线粒体置换，用来自供体的健康mtDNA替换有缺陷的mtDNA[4-5]。

1 线粒体结构

线粒体位于细胞质中，具有双层膜结构，一般长0.5～1 μm。线粒体拥有自己的DNA，称为mtDNA。mtDNA共有37个基因，可以编码2种rRNA、22种tRNA和13种多肽[6]。线粒体至少需要2 000多种蛋白才能维持其正常的功能，而绝大多数的蛋白仍需细胞核中的基因进行编码。

线粒体的双层膜分别是位于线粒体最外层的线粒体外膜(MOM)和位于线粒体内侧的线粒体内膜(MIM)[7]。MOM维持线粒体的基本形状，并隔绝线粒体基质与细胞质。由于MOM与细胞质相通，因此膜间隙的pH值与细胞质的相似。MOM的通透性大，因此还具有物质交换平台的功能。MIM折叠成嵴，通透性小，其上分布着两条电子传递链(ETC)，是进行有氧呼吸的重要场所。MIM与MOM之间的腔隙称为膜间隙(宽6～8 nm)，延伸至嵴的轴心部。基质为MIM包围着的空间，催化三羧酸循环、脂肪酸和丙酮酸氧化的酶均位于线粒体基质中。除糖酵解在细胞质中进行外，其他的生物氧化过程都在线粒体中进行。

2 线粒体功能

线粒体的核心功能是为细胞提供生命活动所需的能量。除此之外，线粒体还有许多额外的功能，包括产生ROS、维持钙稳态、调控细胞凋亡过程和内质网(ER)应激等。

2.1 能量供应

细胞的正常生命活动离不开能量。线粒体产生ATP，满足细胞的大部分能量需求。在细胞的能量代谢过程中，不同的能量底物转换为乙酰辅酶A后进入三羧酸循环。在氧化磷酸化的过程中，线粒体使用三羧酸循环产生的NADH和FADH作为底物，为位于MIM上的电子传递链提供动力。简单来说，NADH向电子传递链复合物I提供一个电子，这使得一个氢原子可以逆浓度进入内膜中，并以此形成了MIM上的膜电位(140～180 mV)[8]。ETC复合物V使用膜电位的能量使ADP变为ATP，同时氢原子回到线粒体基质中。当电子到达ETC复合物IV时，氢原子被释放回线粒体基质中并在此与氧结合，最终产生水分子。

2.2 ROS的产生

线粒体在产生能量的过程中，从ETC释放的电子将氧还原为超氧化物，从而以超氧自由基(O2-)的形式产生少量的ROS。位于线粒体内的锰超氧化物歧化酶(MnSOD)将超氧化物氧化成活性较低的过氧化氢[9-10]。过氧化氢可以发生芬顿反应产生羟基自由基(OH-)，从而破坏脂质、蛋白质和核酸[11]。谷胱甘肽(GSH)过氧化物酶可以将过氧化氢转化为水[12]。

2.3 维持钙稳态

研究表明线粒体内钙离子能够调节许多生理病理过程。线粒体具有动态性，可以定位于细胞内的任何位置。作为钙离子依赖型效应器，线粒体在很多生化过程(例如能量的产生和细胞的死亡)中起到重要作用。作为钙离子进入线粒体的第一道屏障，MOM高表达电压依赖型阴离子选择性通道蛋白(VDAC)，进而维持对钙离子的高渗透性。正常情况下，细胞质内的钙离子浓度为0.1 mmol/L，细胞外钙离子浓度为1 mmol/L，这有利于钙离子从细胞外向细胞质内流[13]。线粒体基质和MIM的膜电位分别为-240 mV和-180 mV，钙离子更倾向于通过钙单向转运蛋白从细胞质向线粒体基质移动[14]。之前的研究指出当线粒体基质内的钙离子浓度比细胞质内高106倍时，膜电位才能达到平衡[13]。钙离子可以通过钠-钙交换系统和膜转运孔道进入胞质，从而改变胞浆中的钙离子浓度。钙离子流入和流出线粒体的能力为线粒体维持细胞质钙稳态提供了理论基础。当细胞受到Ins(1,4,5)P3刺激时，钙离子从ER释放，细胞质中钙离子浓度升高。线粒体上MCU蛋白的过表达可增强线粒体摄取钙离子的能力，从而减轻Ins(1,4,5)P3引起的细胞质钙超载。此外，使用PDZD8刺激神经元时，线粒体对内质网释放的钙离子吸收能力减弱，细胞质中钙离子浓度明显升高。总的来说，线粒体可在多个层面、多个水平上调控钙离子浓度，有助于维持钙稳态。钙离子与许多生理活动息息相关，例如可以促进各种代谢酶的激活从而使ATP的产量增加，并且与细胞信号转导、能量代谢、细胞凋亡等有关[15]。

3 线粒体移植在心肌缺血性损伤中的应用

心肌缺血损伤是由冠状动脉血流减少或中断，导致输送到心肌的氧气不足以维持心肌细胞的正常功能而产生的。线粒体是心肌细胞的“发电厂”，为心肌细胞产生超过95%的ATP。在受到缺血缺氧刺激时，线粒体功能受损，无法维持心肌细胞的正常功能。研究表明，心肌缺血发生后，线粒体的体积[16]、氧化磷酸化能力[17]、线粒体钙离子[18-20]、线粒体酶活性(细胞色素氧化酶)、线粒体复合物活性[21]、能量合成能力[20]、mtDNA[22]、线粒体调节的细胞死亡途径[23-24]，以及线粒体转录组学和蛋白质组学[21,24-25]发生改变。所有这些有害事件都发生在心肌缺血期间，并在组织再灌注恢复后持续存在，导致缺血后细胞活力降低，心肌功能恢复严重受损[16-25]。基于此，科学家们在近十年来提出心肌线粒体移植的概念。

线粒体移植是将健康线粒体注射到受损器官中的治疗方法。2009年，在兔缺血心脏模型中首次验证了线粒体移植的作用[26]。研究者在兔缺血后再灌注之前，从供体兔的健康左心室组织中分离出有活力的、有呼吸能力的线粒体注射到离体心脏的缺血区。结果发现移植了健康线粒体的缺血心脏的ATP含量增加，梗死面积减少，心肌细胞损失减少和心脏功能改善。共聚焦显微镜显示注射的线粒体在再灌注120 min后存在并存活，并且从心外膜分布到心内膜。Blitzer等[27]通过结扎左前降支建立了猪的缺血/再灌注模型，结果表明，接受线粒体移植治疗的猪的射血分数和缩短分数显著增加，心肌梗死面积显著减少，但是与对照组相比危险区的比例无显著差异。Moskowitzova及其同事[28]在小鼠上进行心脏移植时，从腓肠肌中分离出1×108个同种异体线粒体，通过冠状动脉口顺行输送到冠状动脉进行治疗。结果表明，线粒体移植治疗显著延长了冷缺血时间，增强了移植心脏的功能，并减少移植物组织损伤。Sun等[29]的研究显示乙醛脱氢酶2(ALDH2) 激活剂Alda-1显著增强了线粒体移植对小鼠心肌缺血再灌注的疗效，表明ALDH2的激活能增强移植的线粒体功能。

2016年，研究者在心肌缺血再灌注损伤的儿科患者中完成了线粒体移植治疗的首次临床应用。因缺血再灌注相关的心肌功能障碍而无法脱离体外膜肺氧合(ECMO)支持的5名危重患者接受了从自身腹直肌分离的线粒体移植治疗[30]。结果表明，5名患者的心肌收缩功能都有显著改善，4名患者在线粒体移植后第二天成功脱离了ECMO支持。该研究表明线粒体移植在改善人类缺血再灌注损伤后的心肌功能障碍中的潜在作用。关于心肌缺血损伤的线粒体移植治疗研究见表1。

表1 心肌缺血损伤的线粒体移植治疗研究

4 线粒体移植治疗的机制

线粒体吸收受到其数量、质量及转运方式有效性等的影响，预计不同患者线粒体治疗的疗效也不同，因此在临床应用线粒体移植之前，需要更好地了解线粒体吸收的机制[35]。

目前线粒体移植治疗的机制仍存在较大争议。据McCully等[36]推测，移植的线粒体对缺血性心脏产生保护作用的机制是线粒体可以促进心肌功能，并且移植的线粒体在细胞外和细胞内都起作用。第一种可能是，线粒体在移植后10 min就可直接激活心脏细胞中的ATP合成，增加ATP含量。第二种可能是，移植的线粒体通过肌动蛋白依赖型内吞作用进入心脏细胞，进而调节细胞因子，而这些细胞因子可以促进细胞的生长和增殖，从而促进血管生成和保护心肌细胞免受凋亡的影响。第三种可能性是，移植线粒体在心肌缺血期间用正常的mtDNA取代受损的mtDNA，进而增加ATP的合成能力。但是Huynh[37]指出了线粒体移植机制上的一些问题，对McCully团队的研究提出质疑：①血液和细胞外液与线粒体相比含有较高浓度的钙离子，这有可能引起线粒体的钙超载，导致线粒体功能障碍，无法保证进入血液中的线粒体仍具有活性；②据McCully团队的报道[26]，线粒体移植后仅需几分钟的时间即可促进实验兔的心脏功能，而线粒体进入心肌细胞却需要几个小时[34]，假如是移植的线粒体产生的ATP改善缺血心脏功能，那么意味着线粒体在心肌外就向心脏提供能量，这显然难以解释；③线粒体进入心肌细胞的机制尚不明确，从文献来看仅有极少的线粒体进入了受体细胞，而少量的线粒体难以产生足量的ATP供给心肌。综上，虽然线粒体移植技术已经得到多个实验室和多个实验模型的证实，但其具体的作用机制仍未得以阐明。

目前，已经有很多动物以及细胞试验验证了线粒体移植技术的可行性，但线粒体移植的具体机制尚未被完全揭示，这严重限制了该技术的发展与应用。

5 线粒体移植治疗的局限性

尽管线粒体移植在治疗缺血性疾病方面已经显现出巨大的前景，在推广应用之前仍然有许多亟需解决的问题。

5.1 潜在的免疫反应

线粒体移植中是否发生免疫反应仍然存在争议。一些研究显示线粒体移植后未出现明显的免疫反应，如Masuzawa等[38]研究了兔缺血性心肌病模型接受线粒体移植治疗后的免疫反应，结果显示血清中各种炎症标记物都没有显著增加，也未检测到抗线粒体相关的抗体。Kaza等[39]也报道了猪缺血再灌注模型中，自体线粒体移植后的炎症因子并未显著增加。Ramirez-Barbieri等[40]证实在小鼠腹腔内单次或多次注射同源线粒体后，小鼠的免疫反应和损伤相关分子模式(DAMP)没有明显的改变。另有一些研究则表明线粒体移植后出现了免疫反应， Lin等[41]研究发现在心脏移植模型中，受体小鼠内皮细胞吸收供体小鼠的细胞外线粒体，引起血管内皮细胞表面黏附分子(CD54/ICAM-1、CD106 /VCAM-1和CD62E/E-selectin)表达升高，从而导致中性粒细胞、单核细胞和淋巴细胞对内皮细胞的黏附增多，炎症反应增加。他们的结果还显示，在小鼠心脏移植模型中，移植的心脏中的线粒体促进了排斥反应。Pollara等[42]报道，在进行人体器官移植时，捐献者器官血液中的线粒体衍生的DAMPs增多，从而导致受者体内炎症相关的细胞因子的水平明显升高。了解线粒体移植过程中出现免疫反应的机制，对于降低线粒体移植的风险具有巨大的价值。

5.2 线粒体的来源和分离方法

为了避免潜在的免疫反应，既往的线粒体移植研究中大多使用来自自体组织分离的线粒体，这限制了线粒体的来源，尤其是对于那些先天性线粒体功能障碍的患者来说。另外，线粒体发挥的作用是即时性的，线粒体的单次使用并不能维持长期治疗效果，这进一步增加了对线粒体来源多样性的需求。最早的线粒体分离方法可以追溯至20世纪，取新鲜的肝脏组织研磨，而后在盐溶液中低速离心，从而得到分离的线粒体[43-46]。随后出现了研磨和差速离心相结合的方法，通过多次研磨和差速离心得到线粒体[47-48]。2013年Schmitt等[48]研发了从细胞和组织中分离线粒体的半自动化方法，并证明可以从冰冻组织或器官中分离得到完整的线粒体，这对临床研究意义重大。目前的研究主要通过在冷却的缓冲液中差速离心来分离线粒体[49-51]。

5.3 线粒体的储存

线粒体是具有生物活性的细胞器，分离后的线粒体需要合理的储存。线粒体处于冷藏或冷冻状态时，其外膜和内膜会被损坏。MIM受损时，氧化磷酸化障碍，ATP和氨基酸等生物分子的合成能力受损，某些分子的MIM传输受损，pH值梯度和膜电位降低，能量生成减少。当MOM受损时，线粒体失去完整性，膜渗透性增加，导致蛋白质(包括细胞色素c(Cyt c))从线粒体释放，细胞会不可避免地发生凋亡[52]。

McCully等[53]报道，分离的线粒体在冰上储存超过1 h后活性显著降低，因此快速操作至关重要。如果可以使用储存的线粒体进行移植，而不是每次使用前即时分离线粒体，线粒体移植的临床应用价值将显著提高。Gnaiger等[54]提出，将线粒体冷藏储存在HEPES-蔗糖的缓冲液24 h后，线粒体呼吸能力仍能保持在80%以上。此外，在保存缓冲液中添加Cyt c可使线粒体呼吸能力在冷藏24 h内保持不变。另有一些研究探讨了大鼠肝脏中分离的线粒体储存在Eurocollins和UW溶液中的情况[55-57]：当线粒体储存在Eurocollins溶液中时，可以观察到线粒体的扩张，且由于缺乏抗氧化剂，复合物III和IV的活性丧失；而UW溶液含有抗氧化剂(如别嘌呤醇、腺苷和谷胱甘肽)，它可以使分离的线粒体的Cyt c的含量和复合物II的活性在储存24 h内保持不变。Greiff等[58]则研究了冷冻储存在二甲基亚砜(DMSO)或甘油中线粒体的功能：线粒体储存在-65 ℃以下10%DMSO中18天或10%甘油中15天时，其氧化磷酸化能力保持不变。Nukala及其同事[59]评估了线粒体在-80 ℃的10%DMSO保存溶液中冷冻1周后的活性，结果表明含有DMSO的保存溶液保留了线粒体的氧化磷酸化能力。另外，与正常线粒体相比，在10%DMSO中储存的线粒体的Cyt c的含量减少。线粒体储存在30%甘油中时其氧化磷酸化能力丧失，而储存在30%DMSO中时其氧化磷酸化能力得以保留，表明DMSO的毒性低于甘油[58]。与正常线粒体活性相比，当使用DMSO储存线粒体时，线粒体活性仍是降低的[59]。综上所述，DMSO的优点是可以防止冻融时线粒体膜的损伤，但缺点是不能保留Cyt c。Yamaguchi等[60]探讨了海藻糖对线粒体冷冻保存的保护作用，线粒体在蔗糖/甘露醇缓冲液中解冻后15 min内释放95%的细胞色素c，而使用海藻糖时，可以在解冻后45 min内保留大约95%的Cyt c。此外，该研究表明线粒体在海藻糖中冷冻保存时不会诱导细胞凋亡，然而其ATP合成能力和线粒体呼吸能力降低至正常水平的30%左右。因此，我们显然需要开发一种新的线粒体储存方案来保持线粒体的正常生物活性。

6 结论

线粒体功能障碍是心肌缺血损伤的主要特征。缺血下的线粒体异常包括线粒体的结构、功能、钙离子、线粒体蛋白、能量合成、mtDNA结构、转录组的改变。线粒体移植治疗应用有活性的、呼吸能力强的线粒体取代缺血心脏中受损的线粒体，这种新的治疗方法已被证明可以减轻心肌梗死的严重程度，改善细胞生存能力。心肌线粒体移植的已知机制包括增加心肌ATP含量、刺激细胞因子的释放以及替换受损的mtDNA。此外，线粒体分离是一种简单、快速的技术，这为线粒体移植治疗的推广提供了实际基础。线粒体移植的潜在应用对象比比皆是，因为线粒体损伤是包括阿尔茨海默病，帕金森病，肝、肾、脑和心肌缺血性损伤，以及罕见的线粒体遗传性疾病在内的大量疾病的基础。

尽管线粒体移植治疗发展迅速，也已被证明是有益的，但是在广泛推广使用之前，仍有许多非常重要的问题亟需解决。目前线粒体结合到宿主细胞的机制仍未被完全了解。一些实验室发现，线粒体与受体细胞体外共同培养即可刺激外源线粒体的吸收，并增加受体细胞的活力，而另一些实验室则未发现这种线粒体的结合。这是否是由于不同的研究之间存在重大技术差异，或者有其他混淆因素尚不清楚。多项研究表明，只有受损的细胞能够吸收外源性线粒体。然而，同样有多个研究观察到健康细胞对线粒体的吸收。宿主细胞的损伤类型也可能是一个关键因素，细胞是否经历外源性的压力、mtDNA是否耗竭、ETC是否受损害，这些都可能决定细胞是否可以吸收线粒体。

线粒体移植是一个充满前景的治疗方法，为缺血性心脏病的治疗提供了宝贵的策略，并为人们更深入了解线粒体的功能和治疗潜力打开了大门。未来需要更多基础和临床研究来验证该治疗的安全性和长期结果。