基于网络药理学探讨三子养亲汤治疗慢性阻塞性肺疾病的作用机制

马馨蕊 吕晓东 庞立建 刘勇明 梁元钰

(1 辽宁中医药大学，沈阳，110847； 2 辽宁中医药大学附属医院，沈阳，110032)

慢性阻塞性肺疾病(Chronic Obstructive Pulmonary Disease，COPD)是一种常见，可预防和可治疗的疾病，其特征在于持续的呼吸道症状和气流受限，这是由于气道和(或)肺泡异常所致，通常是由于长期暴露于有害颗粒或气体所引起，最常见的呼吸系统症状包括呼吸困难、咳嗽和(或)咳痰[1]。COPD的高发病率、高病死率、高致残率以及所带来的沉重的疾病负担，使其成为全球重要的公共卫生问题之一[2]。COPD的最主要危险因素为吸烟，除此之外研究发现还包括室外空气污染、职业暴露、呼吸道感染、哮喘和气道高反应性、结核、肺发育不良、遗传因素、贫穷和较低社会经济地位、室内生物燃料及人类免疫缺陷病毒感染等危险因素[3]。临床上可根据患者病史及临床表现进行诊断，并通过肺功能检查以明确诊断。如支气管扩张剂后第1秒钟用力呼气容积(Forced Expiratory Volume in One Second，FEV1)/用力肺活量(Forced Vital Capacity，FVC)<0.70，可确定存在持续气流受限[4]。在西医治疗与预防过程中，因吸烟是COPD首要的危险因素，因此戒烟是其主要的治疗和预防方法之一。同时临床常使用支气管扩张剂，同时还可应用糖皮质激素和祛痰剂[5]。

网络药理学提供了一种系统性地寻找中药复方活性成分和作用靶点的新方式，契合于中药多成分-多靶点的作用关系，有利于挖掘中药整体调控的分子机制[6]。为研究传统中药与现代药理学之间的相互关系搭建了桥梁[7]。本研究是通过运用网络药理学的研究方法，通过在数据库中搜索三子养亲汤的有效成分和靶点以及COPD相关的基因和蛋白，构建出药物-靶点-基因三者之间相互关联的网络，对该网络进行功能富集分析，分析三子养亲汤治疗COPD的作用机制和作用通路，为其在现代化的研究中提供新方向。

1 资料与方法

1.1 三子养亲汤有效成分及对应靶点筛选与预测 通过中药系统药理学数据库与分析平台(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP)检索三子养亲汤中紫苏子、白芥子、莱菔子3味中药的化学成分的分子信息。检索过程中，加入口服生物利用度(Oral Bioavailability，OB)≥30%、类药性(Drug Likeness，DL)≥0.18 2个筛选条件，筛选出这3味中药各自的有效成分，并在TCMSP获取得到中药有效成分相对应的靶点。

1.2 COPD靶点获取 通过GeneCards数据库以“chronic obstructive pulmonary disease”为关键词检索，选择物种为“Homo sapiens”，筛选出与COPD疾病相关的基因。

1.3 三子养亲汤治疗 COPD的靶点预测将三子养亲汤有效成分靶点和COPD疾病靶点取交集得出药物与疾病的共同核心靶点，并绘制韦恩图。

1.4 网络图的构建 首先利用Cytoscape 3.7.0软件构建三子养亲汤有效成分-核心靶点-COPD相关基因的网络图，并建立三子养亲汤药物-靶点-COPD相关基因的网络。将获取的疾病与成分的共同靶点导入STRING数据库，选择物种为homo sapiens，最高置信度设置为0.7，去掉游离在外的节点，构建蛋白质-蛋白质相互作用(Protein-protein Interaction，PPI)网络图。并对PPI网络结果进行分析，得到网络图中的核心基因。

1.5 基因本体(Gene Ontology,GO)富集分析和京都基因和基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)富集分析 将药物与疾病的共同核心靶点转换为entrezID，对其进行富集分析，包括GO功能富集分析和KEGG信号通路富集分析。通过2种富集分析，找出三子养亲汤治疗COPD的关键靶点蛋白和三子养亲汤治疗COPD的相关重要信号通路。取排名前20的结果。分别以柱状图和气泡图进行展现。

2 结果

2.1 三子养亲汤的有效成分及靶点预测 得到的三子养亲汤有效成分共22个，其中包括的有效成分中紫苏子16个、白芥子3个、莱菔子3个。三子养亲汤有效成分靶点预测共得到231个作用靶点,并得到其靶点的symbol。COPD靶点预测结果的5 737个基因。

2.2 COPD靶点预测 收集到COPD的相关基因5 737个。

2.3 三子养亲汤有效成分-核心靶点-COPD基因的网络构建 共有关键靶点115个，包括PGR、PTGS2、ADRB2、MAOB、PRSS1、NR3C2、NCOA2、ADH1C、RXRA、NCOA1等。见图1。

图1 三子养亲汤与COPD靶点的韦恩图

网络中红色菱形代表COPD疾病，黄色代表三子养亲汤，蓝色三角形为115个共有靶点，天蓝色长方形为三子养亲汤有效成分，线条为成分与靶点之间相互作用关系。见图2。

图2 三子养亲汤-有效成分-共同靶点网

2.4 三子养亲汤治疗COPD的PPI网络 网络中节点数量115,边数606，平均节点度10.5。调整最高置信度为0.7，去掉游离的节点后，其核心靶点数为107个。见图3。PPI网络中心的蛋白质显示其前20个结果包括AKT1、MAPK1、IL6、JUN、CASP3、EGFR、VEGFA、EGF。见表1。

表1 三子养亲汤治疗COPD的核心靶点

图3 三子养亲汤治疗COPD的PPI网络

2.5 GO功能富集分析与KEGG信号通路富集分析GO功能富集分析 得出了170个相关条目，主要涉及有DNA-binding Transcription Factor Binding(DNA结合转录因子结合)、Ubiquitin-like Protein Ligase Binding(泛素样蛋白连接酶结合)、RNA Polymerase Ⅱ-specific DNA-binding Transcription Factor Binding(RNA聚合酶Ⅱ特异性DNA结合转录因子结合)、Ubiquitin Protein Ligase Binding(泛素蛋白连接酶结合)、Amide Binding(酰胺绑定结合)、Endopeptidase Activity(肽链内切酶活性)等方面。并筛选其主要20个条目。见图4。KEGG信号通路富集分析结果共得到162个信号通路，由结果分析得到三子养亲汤治疗COPD主要通过Lipid and Atherosclerosis、PI3K-AKT Signaling Pathway、Human Cytomegalovirus Infection、AGE-RAGE Signaling Pathway in Diabetic Complications和Endocrine Resistance等信号通路表达，并通过柱状图(图5)和气泡图(图6)显示其主要的20个信号通路。参与Lipid and Atherosclerosis信号通路的基因包括MMP1、AKT、PKCα、ERK、IL-6、CD40L等，参与PI3K-AKT信号通路涉及RTK、GF、AKT、GPCR等基因(图7)。

图4 三子养亲汤治疗COPD的GO富集分析气泡图

图5 三子养亲汤治疗COPD的KEGG信号通路柱状图

图6 三子养亲汤治疗COPD的KEGG信号通路气泡图

图7 PI3K-AKT信号通路

3 讨论

在古代中医学中，没有具体记载慢性阻塞性肺疾病的中医命名，现代医家主要将其归属于“肺胀”“咳嗽”“喘证”“痰饮”等疾病范畴。“肺胀”最早于《黄帝内经》中所提出，其中原文记载“肺胀者，满而喘咳”。有关肺胀的症状表现，张仲景在《金匮要略》中提出“咳而上气，此为肺胀，其人喘，目如脱状，脉浮大”。现代医家总结了肺胀的病因病机，认为痰邪伏肺是肺胀的夙根，本虚标实是该病的主要机制，肺胀多因久病肺虚，复感外邪，引动夙根，使痰浊阻肺，久而化热，形成痰热壅肺，进一步演变至肺气郁滞，腑气不通，使痰浊闭窍[8]。COPD可分为稳定期和发作期。现代医家在分别对于稳定期和发作期的治疗过程中，稳定期以肺脾肾三脏气阳虚衰为主，兼夹标实之证，临床上以补益肺脾肾为主，辨治时各有偏重，在补虚的同时少佐化痰活血泄实邪等药物，发作期时，气滞、痰浊、血瘀是其主要病理因素，本虚是其主要病机，治疗以调畅气机，痰瘀并治为主，佐以补虚药或敛肺药，中医外治疗法可应用穴位贴敷、针灸拔罐、穴位注射以及练习八段锦，提高免疫力和改善肺功能[9]。

三子养亲汤出自《韩氏医通》，是治疗COPD的常用的基础方剂。包括紫苏子、白芥子、莱菔子3味中药。紫苏子，别名苏子、黑苏子等，辛，温。归肺、脾经，有降气消痰、平喘、润肠之功效。白芥子，别名辣菜子，辛、温，归肺、胃经。有温肺豁痰利气，通络止痛的作用。莱菔子，别名萝卜子、芦菔子等，辛、甘、平，归肺、脾、胃经。可降气化痰，消食化积。故3味药共奏健脾祛湿、降气化痰、止咳平喘之功效。三子养亲汤在现代中医中多用于治疗支气管炎、COPD、支气管哮喘、肺源性心脏病[10]。现代药理学研究认为，三子养亲汤具有镇咳、祛痰、平喘、抗炎的药理作用，且白芥子的祛痰作用较紫苏子强，而紫苏子的平喘作用较白芥子强，镇咳则以莱菔子作用最强[11]。3者配伍用药，更强化其作用效果。王永奇等[12]对紫苏子的提取物研究发现，紫苏子中水提物、醇提物、醚提物均有一定程度的镇咳作用，其水提物有明显的祛痰作用。邱岳等[13]研究得出三子养亲汤能改善FVC、FEV1、FEV1占预测值百分比，FEV1/FVC(%)、PaO2、PaCO2、中医证候积分等相关指标，提高临床总有效率。证明其在治疗COPD所表现的咳喘、咳痰、肺功能下降等具有极佳的临床疗效。

本研究通过数据库的检索收集得到COPD的5 737个靶点，提示COPD的产生多由多个靶点共同影响所引起的。用TCMSP筛选出三子养亲汤的有效成分共22个，得到其有效成分的231个作用靶点，体现了中药方剂多味药、多成分、多靶点、多作用途径的整体作用特点。与COPD相关基因共有115个共有靶点。通过GO富集分析，提示治疗COPD的分子功能和生物过程主要涉及DNA结合转录因子结合、泛素样蛋白连接酶结合、RNA聚合酶Ⅱ特异性DNA结合转录因子结合、泛素蛋白连接酶结合、酰胺绑定、肽链内切酶活性等。治疗COPD的生物学过程中涉及的最主要核心靶点包括AKT1、MAPK1、IL6、JUN、CASP3、EGFR、VEGFA、EGF、MYC、CCND1等。并通过Lipid and Atherosclerosis(脂质和动脉粥样硬化)、PI3K-AKT Signaling Pathway(PI3K-AKT信号通路)、Human Cytomegalovirus Infection(人巨细胞病毒感染)、AGE-RAGE Signaling Pathway in Diabetic Complications(糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路)、Endocrine Resistance(内分泌抵抗)等多条通路，起到治疗作用。

白细胞介素-6(Interleukin，IL-6)在COPD的发生发展过程中起着一定的作用，与COPD的病情严重程度有关[14]。IL-6炎症介质增多可导致炎症反应[15]。王惠欣[16]发现COPD患者急性加重期和稳定期的IL-6表达水平与FEV1/FVC负相关，提示IL-6可以使患者的肺功能下降，使病情进展。童卫泉等[17]实验研究发现雷帕霉素降低COPD大鼠血管内皮生长因子表达水平，能够抑制气道重塑，改善COPD。PI3K/AKT信号通路参与了包括细胞凋亡、增殖、侵袭和炎症的过程[18]。有研究显示蛋白激酶B是PI3K/AKT信号通路的关键蛋白，抑制PI3K/AKT信号通路能有效降低黏液蛋白5AC的表达[19]。黏液蛋白5AC是一个重要的小气道上皮大分子黏蛋白，参与调控气道黏液的分泌[20]。黏液蛋白5B为气道黏蛋白的重要成分之一，IL-6介导JAK2依赖的自分泌或旁分泌途径可促进黏液蛋白5B基因的表达，同时还可通过ERK信号转导通路上调黏液蛋白5B基因的表达[21]。有研究显示对小鼠进行动脉粥样硬化饮食喂养后会出现慢性肺部炎症反应[22]，提示动脉粥样硬化可能在COPD的进展中具有一定的影响。这些靶点与靶点、通路与通路以及靶点与通路之间的联系，均影响三子养亲汤对COPD的治疗效果和病情的进展。

本研究通过网络药理学的研究方法，分析方剂对疾病的治疗机制，但对于方剂的药物计量、配伍比例,以及药物煎煮过程中的化学变化未考虑在内，使研究结果存在局限性，有待进一步研究和发现。

综上所述，三子养亲汤可通过AKT1、MAPK1、IL6、EGFR、VEGFA、EGF等多个核心靶点于Lipid and atherosclerosis、PI3K-AKT signaling pathway等信号通路中，起到治疗COPD的作用。该研究结果为后续深入研究三子养亲汤治疗COPD的疗效机制提供了基础资料。