网果酸模提取工艺优化及其提取物对幽门结扎大鼠胃酸胃蛋白酶的影响❋

王瑞海， 许 京， 刘丽梅， 苗 青， 严光俊， 郭昌洪， 蒋学斌△

(1.中国中医科学院中医基础理论研究所， 北京 100700；2.湖北省荆州市中医医院，湖北 荆州 434000)

胃炎是一种急性或慢性弥漫性或局限性的胃壁膨胀[1]，由多种因素引起，包括幽门螺杆菌感染、阿司匹林等药物诱导、非甾体抗炎药、皮质类固醇和酒精摄入[2]。胃炎最常见的症状包括上腹痛、胃灼热、恶心和呕吐[3]。在众多致病因素中，幽门螺杆菌感染是其主要原因[4]，研究证实其与上消化道疾病密切相关[5]。对于幽门螺杆菌感染，临床通常采用三联疗法[6]，尽管目前的治疗方法可以缓解胃炎的一些主要症状，但新耐药幽门螺杆菌菌株的出现[7，8]，同时治疗药物引发了一系列严重的副作用[9]，因此仍然有必要寻找新的、安全的预防策略。中医药是一种综合性医疗体系，对亚洲人的健康维护起着重要作用，由于其可靠的疗效和较少的副作用[10，11]，为预防和治疗胃炎等复杂疾病提供了广阔的前景。

网果酸模(RumexchalepensisMill.)为地方(湖北荆州)常用草药，具有清热解毒、通便、杀虫等功效，民间用于止血和治疗痢疾[12]。网果酸模中含有的酸模素具有很强的抗真菌(白色念珠菌、红色发癣菌)活性[13,1415]，大黄素、大黄酚等蒽醌类化合物对幽门螺杆菌均有较强的抑制生长作用[16-171819]，但其提取工艺未经过优化，抑制幽门螺杆菌活性未见报道。因此，本文以大黄素-8-β-D-吡喃葡萄糖苷、大黄酚-8-O-β-D-葡萄糖苷、酸模素、大黄素、大黄酚和大黄素甲醚的总提取率及抑菌(幽门螺杆菌)环为指标，优化网果酸模提取工艺，为其提高临床疗效提供科学依据。本研究通过中国中医科学院中医基础理论研究所伦理委员会审查(批号2019-054)。

1 材料

1.1 动物

SPF级SD雄性大鼠48只，体质量200±20 g，由斯贝福(北京)生物技术有限公司提供，许可证号SCXK(京)2016-0002。自由饮水摄食，人工光照，12 h的明暗周期，室内温度控制在21～24 ℃，空气流通。

1.2 药物

奥美拉唑肠溶胶囊(修正药业集团长春高新制药公司，批号180310)。

1.3 主要试剂及仪器

胃蛋白酶测定试剂盒(南京建成生物工程研究所，货号A080-1-1)；大黄素-8-β-D-吡喃葡萄糖苷对照品(成都埃法生物科技有限公司，批号AF8032001)；大黄酚-8-O-β-D-葡萄糖苷对照品、酸模素对照品、大黄素对照品、大黄酚对照品、大黄素甲醚对照品(成都普思科技股份有限公司，批号分别为PS010712、PS170608-03、PS000259、PS010475、PS000263)；幽门螺杆菌SS1株(上海市消化疾病研究所，批号ATCC43504)；哥伦比亚血平板(法国科玛嘉，批号181015)。药材采集于湖北省荆州市，经黑龙江中医药大学王振月教授鉴定为蓼科酸模属植物网果酸模RumexchalepensisMill.干燥的根及根茎。

Agilent 1100高效液相色谱仪(美国安捷伦公司)；Agilent Extend-C18色谱柱(4.6×250 mm，5 μm)(美国安捷伦公司)；HW SY11-K电热恒温水浴锅(北京市长风仪器表公司)；98-1-B电子调温电热套(天津市泰斯特仪器有限公司)；ICH110培养箱(德国美墨尔特有限公司)；1300A2生物安全柜(赛默飞世尔科技(中国)有限公司)。

2 方法

2.1 提取工艺的优化

2.1.1 对照品溶液的制备[20]精密称取大黄酚-8-O-β-D-葡萄糖苷、酸模素、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚、大黄素-8-β-D-吡喃葡萄糖苷对照品适量，精密加入甲醇配制浓度为500 μg/mL的对照品储备液。精密吸取上述各成分对照品储备液适量，得到含上述各成分的浓度为21.7、49.8、18.7、6.1、9.9及13.3 μg/mL混合对照品溶液。

2.1.2 供试品溶液的制备[21]取干膏粉适量置于具塞三角瓶中，加甲醇40 mL称重，超声提取1 h放置至室温，甲醇补足减失重量，摇匀、静置，取上清液，过0.45 μm滤膜即得。

2.1.3 含量测定[12]采用Agilent Extend-C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)色谱柱，柱温设定为25 ℃。以水(含0.1%甲酸)(A)-甲醇(B)为流动相，梯度洗脱程序为0～14 min，55%～40%A；14～25 min，40%～14%A；25～30 min，14%～0%A，分析时间35 min，流速为1 mL/min，检测波长为254 nm。

2.1.4 抑菌活性实验[22，23]将活化后的幽门螺杆菌接种至6%血清的布氏肉汤中，置于37 ℃摇床微需氧培养3～4 d，调至菌悬液菌浓度为107～108CFU/mL，用玻璃涂布棒均匀涂至哥伦比亚血平板上，室温放置15 min待表面干燥后，将自制网果酸模不同提取工艺药敏纸片贴于培养基表面，置于微需氧培养袋中，37 ℃微需氧培养3 d，用游标卡尺量取完整抑菌圈直径。

2.1.5 指标成分测定[13]以网果酸模大黄素-8-β-D-吡喃葡萄糖苷、酸模素、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚、大黄素-8-β-D-吡喃葡萄糖苷的总提取率和不同提取工艺提取物抑菌环直径为指标，测定提取工艺提取物各成分含量，计算各成分提取率。参照文献测定抑菌环直径，提取率公式如下：网果酸模大黄素-8-β-D-吡喃葡萄糖苷等6个成分总提取率(%)=提取物中大黄素-8-β-D-吡喃葡萄糖苷等6个成分质量和÷药材质量×100%[7]。

2.1.6 网果酸模水提取L9(34)正交试验 经相关文献调研和多次预实验，选择提取时间、料液比、提取次数为考察因素(见表1)。以抑制幽门螺杆菌抑菌环直径、大黄素-8-β-D-吡喃葡萄糖苷等6个成分的总提取率为考核指标，采用L9(34)正交实验法进行实验设计。

表1 网果酸模水提取工艺因素和水平

2.1.7 网果酸模醇提取L9(34)正交实验 采用抑制幽门螺杆菌抑菌环直径、大黄素-8-β-D-吡喃葡萄糖苷等6个成分的总提取率为考核指标，以乙醇浓度、提取时间、料液比、提取次数为考察因素，正交设计因素水平(见表2)。按L9(34)正交实验法对网果酸模进行醇提取工艺的优选。

表2 网果酸模醇提取工艺因素水平表

2.2 网果酸模对幽门结扎大鼠胃酸胃蛋白酶的影响

2.2.1 动物分组 大鼠适应性喂养3 d随机将SD大鼠分为模型组(C)、阳性药奥美拉唑组0.018 g/kg(omeprazole)、中西药联合给药组(奥美拉唑组0.018 g/kg +网果酸模提取物0.780 g/kg，OH)、网果酸模提取物高剂量组0.780 g/kg(H)、网果酸模提取物中剂量组0.390 g/kg(M)、网果酸模提取物低剂量组(L)0.185 g/kg。

2.2.2 造模[24-27]与取材 按文献方法建立幽门结扎大鼠胃损伤模型[28]，末次给药前12 h禁食，自由饮水，末次给药后大鼠给予麻醉处理，减去腹部毛常规消毒，于剑突下沿腹白线开一长约3 cm的切口，小心提起胃，在幽门和十二指肠结合处结扎，缝合伤口后消毒送回笼中，术后禁食禁水，5 h后用麻醉处死动物，开腹结扎贲门取出全胃，倒出胃内容物，离心后取上清液记录胃液总量，留作胃液总酸度及每小时总酸排出量测定。以生理盐水冲洗大鼠全胃，-80 ℃存放，用于胃组织蛋白酶活力的检测。

2.2.3 总酸度[20]、总酸排出量、胃组织蛋白酶活力的测定 采用酸碱滴定法进行总酸度、总酸排出量的测定。依据下列公式计算总酸度、总酸排出量：总酸度 =NaOH浓度×NaOH消耗体积/胃酸体积，每小时总酸排出量=总酸度×胃液量/5。采用ELISA法按试剂盒说明书步骤检测胃组织蛋白酶活力。

2.3 统计学方法

3 结果

3.1 网果酸模提取工艺优化

3.1.1 网果酸模水提取工艺 以抑菌环为考察指标，各因素对水提取工艺影响顺序为提取次数>提取时间>料液比；以大黄素-8-β-D-吡喃葡萄糖苷等6个成分的总提取率为考察指标，各因素对水提取工艺影响顺序为提取次数>提取时间>料液比，2个考察指标中各因素对提取工艺影响顺序一致。方差分析结果表明，提取次数对大黄素-8-β-D-吡喃葡萄糖苷等6个成分的总提取率有显著影响(P<0.05)。结合实际生产的成本，确定网果酸模最佳水提取工艺为药材加12倍量水，煎煮90 min提取3次。按优选的最佳工艺提取3批样品进行验证实验，依法测得网果酸模出膏率分别为41.28%、43.61%和40.53%，大黄素-8-β-D-吡喃葡萄糖苷等6个成分的总含量分别为0.92%、0.88%、0.91%，提取率分别为0.38%、0.38%和0.37%，平均提取率为0.38%。

3.1.2 网果酸模水提醇沉工艺考察 按优选的最佳工艺提取5批样品滤过合并药液，静置沉淀浓缩，加乙醇分别醇沉至含醇量为55%、60%、65%、70%、75%，过夜离心30 min，回收溶剂减压干燥，计算出膏率。测定水提醇沉提取物中大黄素-8-β-D-吡喃葡萄糖苷等6个成分含量，计算提取率、转移率。结果表明，随醇沉浓度的增加，网果酸模中大黄素-8-β-D-吡喃葡萄糖苷等6个成分总提取率及转移率呈先升后降趋势，抑菌环直径呈先上升后平缓趋势，醇沉浓度为65%时，大黄素-8-β-D-吡喃葡萄糖苷等6个成分总提取率及转移率最高为0.28%及33.08%，同时抑菌环直径为12 mm，因此，选取醇沉至含醇浓度为65%进行醇沉。对上述网果酸模水提醇沉工艺进行验证，3批样品的总提取率分别为0.28%、0.27%和0.27%。

3.1.3 网果酸模醇提取工艺 2个考核指标各因素对醇提取工艺影响顺序均为乙醇浓度>提取时间>料液比>提取次数，对网果酸模醇提取影响顺序一致。最佳提取工艺为6倍量75%乙醇回流提取90 min，提取3次。方差分析结果显示，4个因素对网果酸模网果酸模醇提取工艺无显著影响。按优选的最佳工艺提取3批样品进行验证实验，出膏率分别为23.6%、23.1%和22.8%，大黄素-8-β-D-吡喃葡萄糖苷等6个成分的总含量分别为3.13%、3.14%、3.13%，提取率分别为0.74%、0.73%和0.73%，平均提取率为0.73%，转移率分别为85.59%、84.05%和82.69%，平均转移率为84.11%。

3.1.4 网果酸模最佳水提取工艺、水提醇沉工艺、醇提取工艺参数对比 对比最佳水提取工艺、水提醇沉工艺、醇提取工艺、出膏率、6个成分总含量、总提取率及转移率参数对比(见表3)。结果表明，醇提取工艺出膏率较低，大黄素-8-β-D-吡喃葡萄糖苷等6个成分总提取率和转移率最高(见图1)，空白组纸片附近有菌落、无抑菌环，与空白组相比网果酸模各工艺提取物均有抑菌作用，醇提取工艺抑菌环较大，因此网果酸模应采用75%乙醇提取。

表3 网果酸模3种工艺参数比较

A. 空白组； B. 水提工艺组； C. 水提醇沉工艺组； D. 醇提工艺组图1 网果酸模药敏试验

3.2 幽门结扎大鼠胃液量、总酸度、总酸排出量、胃组织蛋白酶活力

图2示，网果酸模提取物可以抑制幽门结扎大鼠胃液、胃酸的释放，降低胃组织中蛋白酶活力的趋势，其中高剂量组具有显著性，整体呈现剂量依赖性。网果酸模联合奥美拉唑可以极显著地抑制大鼠胃液的释放(P<0.001)，显著抑制胃酸排放(P<0.05)以及降低胃蛋白酶活力(P<0.01)，优于奥美拉唑、网果酸模单独给药。

注: 与模型组比较，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001；C：模型组；omeprazole：奥美拉唑组；OH：奥美拉唑组联合网果酸模高剂量组；H：网果酸模高剂量组，M：网果酸模中剂量组；L：网果酸模低剂量组; A. 胃液量； B. 总酸度； C. 总酸排出量； D. 胃组织蛋白酶活力图2 幽门结扎大鼠胃液量、总酸度、总酸排出量及胃组织蛋白酶活力比较

4 讨论

网果酸模颗粒剂为湖北省中医医院院内制剂，已有30多年的临床应用基础，主要用于治疗幽门螺杆菌感染等相关性胃炎，其制剂采用水提醇沉工艺，未经严格的优化，因此有必要对其提取工艺进行科学优化。2017年，世界卫生组织国际癌症研究机构公布幽门螺杆菌为一类致癌物[29，30]。据报道，全球约75%的胃癌病例和5.5%的恶性肿瘤可能归因于幽门螺杆菌引起的炎症和损伤[31，32]。本文对网果酸模提取工艺进行正交设计，将可能影响其有效成分的因素纳入考察范围，同时对网果酸模中的主要成分进行含量测定，以更加科学合理地控制其质量。此外，加以体外抑菌作为考察指标，更加贴近临床，本研究可为网果酸模的临床应用和质量控制提供技术支撑。

本实验采用正交实验设计，设计方法成熟。实验结果表明，网果酸模不同工艺所得提取物均具有抑制幽门螺杆菌的作用。同时数据显示，网果酸模提取物中大黄素-8-β-D-吡喃葡萄糖苷等6个成分总提取率的高低与其抑菌环的直径大小呈正相关，因此，验证实验及3种工艺比较6个成分提取率即可，同时推断酸模素及大黄素等6种成分可能为网果酸模治疗幽门螺杆菌相关性胃炎的主要有效成分。

胃液由胃黏膜中的壁细胞、主细胞和黏液细胞分泌组成，是消化道重要的消化液，主要成分是胃酸。胃蛋白酶由胃内胃蛋白酶原经过胃酸活化后产生，胃蛋白酶的活性随胃酸分泌增多而增强并诱发自身消化，造成胃黏膜损伤，促进溃疡形成。研究结果表明，网果酸模通过抑制胃酸胃蛋白酶的释放，对胃黏膜起到保护作用，联合奥美拉唑抑制效果更佳，起到质子泵抑制剂的作用。

综上所述，网果酸模最佳提取工艺为6倍量的75%乙醇回流，提取3次，每次90 min。该工艺稳定可行，网果酸模提取物可显著抑制胃酸、胃蛋白酶的释放，为网果酸模的制剂开发、临床应用提供科学依据，为进一步阐明其作用机制奠定基础。