蒲公英多糖提取及其抗氧化活性研究

舒玉凤 卢静静 陈 旭

（武汉设计工程学院食品与生物科技学院，湖北武汉 430205）

蒲公英（Taraxacum mongolicum）味微苦、寒性，具有清热解毒和利尿等疗效[1]。蒲公英含有黄酮、植物甾醇、多糖、三萜类、胆碱等活性物质，具有消除炎症、增强机体免疫力、抵御病毒和防御肿瘤等药理作用[2-4]，是一种药食同源植物[5]，可以用于食品、方剂、保健品和护肤品中。多糖作为蒲公英的活性成分之一，具有提高免疫力、降低血脂、预防衰老和抗辐射等功能，其在医疗和保健方面具有重要的潜在应用价值[6-7]。国内外普遍使用酶解法和热水浸提法提取蒲公英中的多糖[8-9]。热水浸提法受多糖种类的影响较小，且能在保证安全生产的同时统筹降低成本、提高效率，因而较酶解法提取应用范围更广。

自由基又称游离基，是一种能够破坏细胞的化学物质。其可以破坏机体内的遗传基因组织、酶、脂肪、碳水化合物等，从而导致食品腐败变质。目前主要通过添加防腐剂和抗氧化剂，抑制食品中有害微生物生长，减缓食品氧化变质过程。但是，工业合成的抗氧化物存在较多的安全隐患。从食物和天然产物中寻找活性物质，并将其开发成为具有抑菌、抗氧化、降血糖、降血脂及降血压等功效的功能性食品或药物成为研究热点[10]。据文献[11]报道，天然活性成分可提供氢离子或螯合金属离子，达到清除自由基的目的。因此，研究植物及中药提取物对抑制自由基的产生具有重要意义。

本研究采用热水浸提法提取蒲公英多糖，探究影响蒲公英多糖得率的因素，并对此进行优化，确定最佳提取条件，同时研究蒲公英多糖抗氧化活性，以期为进一步开发利用蒲公英多糖提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料及仪器

1.1.1 试验材料。试验材料：蒲公英，购自当地中药店；葡萄糖、浓硫酸、苯酚、乙醇、三氯化铁、硫酸亚铁、DPPH、H2O2和邻苯三酚，均为国产分析纯；试验用水为蒸馏水。

1.1.2 仪器与设备。试验仪器有紫外分光光度计（UV-1800 CP，上海美谱达仪器有限公司）、高速万能粉碎机（FW-200，北京中兴伟业仪器有限公司）、数显恒温水浴锅（HH-S4，金坛市富华仪器有限公司）、电热鼓风干燥箱[DHG-9240（A），上海精宏实验设备有限公司]、离心机（TDL-5-A，上海安亭科学仪器厂）。

1.2 试验方法

1.2.1 原料预处理。选取无虫蛀、无霉斑的干燥蒲公英植株，置于高速粉碎机中粉碎，过60目筛，将蒲公英粉末采用索氏抽提法在50℃条件下用石油醚回流处理4 h后得到脱脂蒲公英粉末，过筛、干燥，备用。

1.2.2 蒲公英多糖提取工艺。称取适量脱脂蒲公英粉末，加入去离子水搅拌均匀，热水浸提后取出，放置于室温下冷却。在4 000 r/min条件下离心10 min，取上清液，加入3倍体积的95%乙醇，密封之后在4℃条件下静置24 h，再次在4 000 r/min条件下离心20 min，数次清洗沉淀，将沉淀用去离子水溶解并定容至100 mL，在490 nm处测吸光度。通过标准曲线计算多糖含量[12]，并按照如下公式计算蒲公英多糖得率：

式中：m1代表多糖质量；m2代表样品质量。

1.2.3 单因素试验。以蒲公英粉末为原料，利用热水浸提法，研究提取温度（50、60、70、80、90 ℃）、提取时间（60、90、120、150、180 min）和 液料比[10∶1、20∶1、30∶1、40∶1、50∶1（mL/g）]对蒲公英多糖得率的影响。

1.2.4 响应面试验。在单因素试验条件下，将Box-Behnken试验作为依据设计试验原理，以蒲公英多糖得率作为响应值，进行响应面试验，并验证最佳工艺条件。试验因素及水平设计见表1。

表1 响应面因素分析水平

1.2.5 抗氧化活性测定。①DPPH自由基清除能力的测定。取2.0 mL不同浓度的样品溶液和0.1 mmol/L DPPH溶液2.0 mL混合，充分摇匀[13-14]，在避光条件下反应30 min，以无水乙醇作为空白，在510 nm波长处测吸光度。以VC作为对照品，3次重复，取平均值。②羟基自由基清除能力的测定。分别取不同浓度样品溶液1.0 mL，加入 1 mL 6 mmol/L FeSO4溶液、1 mL 6 mmol/L水杨酸-乙醇溶液和1 mL 6 mmol/L H2O2溶液，37℃水浴400 min，然后在510 nm处测定吸光度。以相同浓度的VC作为对照，以同体积蒸馏水作为空白组，3次重复，取平均值。③超氧阴离子自由基清除能力的测定。分别取不同浓度的样液2.0 mL，然后加入2.5 mL 0.05 mol/L Tris-HCl缓冲液（pH值=8.8）。在室温下混匀后加入0.1 mL 6 mmol/L邻苯三酚溶液后开始计时5 min，每隔30 s记录在320 nm波长处的吸光度。以相同浓度的VC作为对照，以同体积的蒸馏水作为空白组，3次重复，取平均值。

1.3 数据统计分析

所有试验均平行3次，取平均值。单因素及抗氧化试验数据采用Origin 8.0软件处理，响应面优化试验采用Design-Expert V8.0.6软件分析，并进行模型方差分析。

2 结果与分析

2.1 热水浸提法提取蒲公英多糖研究

2.1.1 单因素试验。从图1（a）可以看出，当温度低于80℃时，温度与多糖得率成正相关。当温度为80℃时，多糖的得率达到峰值，继续升高温度多糖得率降低。原因可能是温度升高，分子反应速度变快，溶剂的渗透性加大，多糖分子的溶出变得更容易，但是多糖在温度过高后容易分解，而蒲公英中黄酮等其他水溶性物质也被提取出来，与多糖发生化学反应，造成多糖含量降低[15]。因此，在80℃下提取蒲公英多糖最好。从图1（b）可以看出，当提取时间小于2.5 h时，提取时间与多糖得率成正相关。当提取时间为2.5 h时多糖得率达到峰值，后面继续增加提取时间，多糖得率下降。原因可能是多糖内部的糖苷键在持续长时间高温条件下发生断裂，造成得率下降。因此，2.5 h是热水浸提法提取蒲公英多糖的最佳时间。从图 1（c）可以看出，在液料比低于 30∶1（mL/g）时，液料比增大与蒲公英多糖的得率成正相关，即溶质的扩散动力与用水量成正相关，蒲公英中水溶性多糖更易溶解出来，使多糖得率持续增大。当液料比大于30∶1（mL/g）时，多糖得率变化较小，可能是液料比为30∶1（mL/g）时多糖几乎全部溶出，浸出率呈现饱和状态。因此，热水浸提法提取蒲公英多糖的最佳液料比为 30∶1（mL/g）。

2.1.2 响应面优化试验。采用Design-Expert V8.0.6软件对表2中试验结果进行多项拟合回归，得到蒲公英多糖得率对提取温度（A）、提取时间（B）和液料比（C）的二次多项回归模型方程：

表2 响应面试验结果

对回归模型进行方差分析，结果见表3。该模型的P值＜0.000 1＜0.01，差异极显著；失拟项的P值为0.074 6，不显著，表明数据没有异常点；决定系数R2=0.998 1，说明响应值的变化有99.57%来源于提取时间、提取温度和液料比3个因素，该回归方程能较好地展现各因素与响应值之间的关系。比较P值与F值大小，可知提取温度（A）的影响最大，提取时间（B）次之，液料比（C）的影响最小。

表3 回归方程系数显著性检验和方差分析

响应曲面坡度体现了响应值面对操作条件改变的灵敏程度，即曲面陡峭度与多糖得率对于提取温度、提取时间、液料比3个条件的改变成正相关。由图2可知，交互作用的影响顺序为AB＞BC＞AC，即提取温度和提取时间两者交互作用对多糖得率的影响最显著，提取温度和液料比的交互作用对多糖得率的影响最小。

2.1.3 最佳工艺条件验证。用回归模型预计测得的热水浸提蒲公英多糖的最佳工艺条件为提取温度83.42 ℃、提取时间 163.2 min、液料比 32.27∶1（mL/g），在此条件下蒲公英多糖得率为66.74 mg/g。

对提取工艺条件按照实际情况进行调整，将提取温度 83.5 ℃、提取时间 163 min、液料比 32∶1（mL/g）作为热水浸提法提取蒲公英多糖的条件。根据调整后工艺条件设置5组平行试验进行验证。结果表明，热水浸提法提取蒲公英多糖得率为（65.87±0.31）mg/g，与理论值相差微小，证明该回归模型获得了较准确的优化参数。

2.2 抗氧化活性测定

对最优工艺条件下提取的多糖进行抗氧化能力研究。 结果表明，蒲公英多糖对 DPPH·、OH·、O2-·3种自由基均有一定的清除作用，对DPPH·的清除能力较强[16]。

3 结论与讨论

本文将单因素试验和响应面分析法优化热水浸提法作为提取蒲公英多糖的工艺参数。结果表明，热水浸提法提取蒲公英多糖的最优条件为提取温度83.5 ℃、提取时间 163 min、液料比 32∶1（mL/g），此条件下多糖得率可达65.87 mg/g。这与李婧雯等[17]研究结果相近。在各影响因素中，影响最大的是提取温度，提取温度和提取时间两者交互作用对蒲公英多糖得率的影响最显著。方差分析中决定系数R2为99.81%，变异系数为0.95%，说明本试验数据稳定、可靠，为蒲公英多糖提取和生产提供了理论依据。

抗氧化活性测定结果表明，蒲公英多糖对DPPH·、OH·和O2-·3种自由基均有一定的清除作用，对DPPH·的清除率较强[16]，可用于天然抗氧化剂开发或功能性食品原料。综上所述，热水浸提法提取蒲公英多糖能提高多糖得率，为进一步开发利用蒲公英提供了参考。