纳米金增强酶联免疫分析法检测面粉中呕吐毒素含量的研究

蔡 娜 沈 佳 史巧巧

（江苏科技大学粮食学院，江苏镇江 212003）

真菌毒素是一类由丝状真菌所产生的有毒次级代谢产物，其种类繁多，存在广泛，大部分具有致癌、致畸、致突变等作用，在极低含量时即可对人体健康与安全构成巨大威胁。呕吐毒素（DON）又称脱氧雪腐镰刀菌烯醇，于1972年由日本的Morooka 等首次分离，其污染率和污染水平居单端孢霉烯族毒素之首，并常与其他真菌毒素协同作用于人体，产生广泛的毒性效应。DON 能侵染大麦、小麦、玉米等谷类作物，可以在粮食生长、收获、储存、加工乃至运输等流程中进行侵染，产生真菌毒素，更可以通过动物代谢作用进一步扩大污染范围，从而对粮食、蔬果和动物性食品造成不可避免的广泛污染。同时DON 具有较高的化学稳定性和热稳定性，在一般的生产加工过程中难以去除[1-3]。国际癌症研究机构（International Agency of Research on Cancer，IARC）已将DON 归为第三类致癌物质。欧盟要求DON 含量要小于1.0 mg/kg，中国饲料要求低于1000 μg/kg。针对DON 污染广、去除难、限量低等特征，开发针对DON的快速便捷、高稳定性、高灵敏度的检测方法具有十分重要的意义。

目前针对DON 的检测方法主要分为仪器检测与快速筛查两类。

仪器检测主要应用于实验室分析，具有灵敏度高、准确度好等优点，主要包括高效液相色谱法和液相色谱-质谱联用技术等，由于其稳定性好、灵敏度高，是世界各国真菌毒素检测的标准仲裁方法。但仪器检测耗时长、操作复杂、设备昂贵、需要专业人员，不利于现场操作使用，无法满足快速、便捷、低成本的检测要求。在仪器检测过程中往往需要先进行富集净化等前处理，从而极大影响检测效率与准确性[4-5]，对样品数量大、种类多、基质复杂的食品检测不太适用。

快速筛查法以免疫分析技术为代表，利用抗原抗体间的特异性亲和能力，广泛应用于大批量样品的现场快速筛查工作，主要包括酶联免疫分析法（ELISA）、胶体金检测试纸条（ICA）等，具有测试操作简单、仪器廉价、检测速度快、样品检测通量高等优点，在大量样品的筛选检测[6-7]中得到广泛应用。但是这些快速检测方法在灵敏度方面仍具有一定的局限性。

我们拟通过制备金纳米颗粒（AuNPs），并将其与HRP-IgG 偶联，制备得到一种高活性的酶-金纳米复合物（HRP-IgG-AuNPs）作为ELISA 中的探针。AuNPs 有许多优良的物理特性，包括与形状相关的光电特性、大的表面体积比、出色的生物相容性、低毒性和价格低廉等特点，可以简单、有效地与抗体蛋白结合，并且其具有辣根过氧化物酶的特性，将其应用于ELISA 中，建立了一种新型的纳米金增强ELISA 方法。与传统ELISA 方法相比，该方法的检测灵敏度提高约13 倍，因此，该方法有望在高灵敏免疫分析方法中获得广泛应用。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

呕吐毒素（DON）、黄曲霉毒素B1（AFB1）、T-2毒素（T-2）、玉米赤霉烯酮（ZEN）、赭曲霉毒素（OTA），Sigma 公司；呕吐毒素包被抗原（DON-BSA）、呕吐毒素单克隆抗体（DON mAb），山东绿都生物科技有限公司；辣根过氧化物酶标记羊抗小鼠二抗（HRP-IgG），华美生物工程有限公司；氯金酸，无水碳酸钾，柠檬酸钠，上海国药公司；普通试剂，均为国产分析纯级。

紫外可见分光光度计，上海光谱仪器有限公司；集热式恒温磁力搅拌器，上海力辰邦西仪器科技有限公司；Tecnai G2 F20 S-TWIN 透射电镜，美国FEI公司；电热鼓风干燥箱，上海一恒科学仪器有限公司；酶标分析仪，深圳雷杜生命科学股份有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 AuNPs 的制备

所用烧瓶均用新配制的王水充分洗净、烘干。取99.0 mL 的超纯水和1% 氯金酸水溶液1.0 mL，加入250 mL 三口圆底烧瓶中，采用140 ℃油浴加热回流，边加热边伴以大力搅拌，直至沸腾，迅速开盖加入1%柠檬酸三钠水溶液1.0 mL，继续加热并大力搅拌，使溶液保持沸腾状态15 min，该时间内瓶中溶液的颜色由淡黄色转为黑灰色，最后变为酒红色且稳定不变色，反应结束后自然冷却至室温，转移至试剂瓶中保存待用。通过透射电子显微镜（TEM）和紫外-可见分光光度计对制备的AuNPs 的粒径和形貌进行鉴定。

1.2.2 HRP-IgG-AuNPs 的制备

取1.0 mL 上述制备的AuNPs 溶液，用0.2 mol/L的K2CO3溶液调节pH 至8.0 左右，然后向该溶液中加入1.0μL 的HRP-IgG，搅拌2 h 后放入4 ℃冰箱反应过夜。然后以12 000 r/min 的速度在4 ℃下离心30 min，保留离心管底部的沉淀，即得HRP-IgGAuNPs。用一定体积的抗体稀释液重悬，于4 ℃冰箱冷藏保存备用。

1.2.3 纳米金增强酶联免疫法的建立

该方法的操作步骤与传统ELISA 的方法相同[8]。首先，采用100 μL/孔DON-BSA 进行包板，37 ℃孵育2 h，PBST 洗板3 次并拍干；每孔用200 μL 含0.2%（w/v）明胶的碳酸盐缓冲液进行封闭，37 ℃孵育1 h，PBST 洗板3 次并拍干；每孔分别加入100 μL 不同浓度的DON 标准溶液和100 μL 适宜浓度的DON mAb 溶液，37 ℃孵育30 min，PBST 洗板3 次并拍干；每孔加入HRP-IgG-AuNPs 溶液100 μL，37 ℃孵育30 min，PBST 洗板3 次并拍干；每孔加入100 μL 显色液，37 ℃避光显色15 min，最后加入100 μL/孔终止液结束反应，用酶标仪读取OD450 nm 值。

1.2.4 样品的加标回收

取经过确证未受DON 污染的面粉样品，分别按照1、5、10 ng/mL 三个水平进行DON添加回收试验。每份样品各称取5.0 g，加入25 mL 超纯水于振荡器上剧烈振荡2 min，超声提取30 min。提取液经5 000 r/min 离心后，上清用PBS 稀释1 倍后进行ELISA 分析。每次实验重复三次，根据读取的OD450 nm 值对照所建立的标准曲线计算测试浓度。

2 结果与分析

2.1 材料的表征

用透射电子显微镜（TEM）观察所制得的AuNPs粒径的均匀程度和大小，见图1。图1 显示，所制备的AuNPs 粒径约为54 nm，形貌良好，多呈圆形或椭圆形，且分散均匀。

通过调整HRP-IgG-AuNPs 溶液浓度与AuNPs的浓度，采用紫外-可见分光光度计进行扫描，设置其波长范围为400～800 nm 之间，结果见图2。图2 显示，AuNPs 的最大吸收峰为536 nm，HRP-IgG-AuNPs的最大吸收峰发生红移，位置在545 nm，因此，初步证明HRP-IgG 已成功吸附在AuNPs 的表面。

2.2 探针偶联条件的优化

2.2.1 AuNPs 偶联最佳pH 值确定

用0.2 mol/L 的K2CO3溶液调节AuNPs 溶液的pH，分别取1 mL 不同pH 的AuNPs 加入1 μL 的HRP-IgG，反应20 min 后加入20 μL 10% NaCl 溶液，具体见表1。用紫外可见分光光度计扫描400～800 nm 范围内的吸收光谱，在pH 位于7.0～8.5 范围内时，AuNPs 的最大吸光度随着pH 的增加而增大，pH 为8.5 时达到最大值，之后吸光度随着pH 的增加而减小，见图3。因此选择pH8.5 作为AuNPs 偶联时的最佳pH。

表1 AuNPs 偶联最佳pH 值确定

2.2.2 HRP-IgG 最佳添加量的确定

在0.5 mL pH=8.5 的AuNPs 中加入不同量的HRP-IgG 溶液，4 ℃反应30 min，再加入20 μL 10%NaCl 溶液，具体见表2。用紫外可见分光光度计扫描400～800 nm 范围内的吸收光谱，HRP-IgG 添加量在0.1～1.4 μL 范围内时，AuNPs-HRP-IgG 吸光度随着HRP-IgG 添加量的增加而变大，HRP-IgG 添加量在1.0μL 时吸光度最大，因为随着HRP-IgG 的不断增加，AuNPs 表面的有效位点越来越多的被占据；当HRP-IgG 的添加量超过1.0 μL 后，达到饱和状态，吸光度变化微小，见图4。因此HRP-IgG 的最佳添加量为1.0 μL。

表2 HRP-IgG 最佳添加量的确定

2.3 纳米金增强ELISA 检测DON

在最优条件下，分别采用纳米金增强ELISA 和传统ELISA 方法对不同质量浓度的DON 标准溶液进行检测，以竞争抗原DON 标准品的质量浓度建立横坐标，以吸光率B/B0值（B 代表各DON 标准品对应的OD450nm值，B0代表DON 浓度为0 时对应的OD450nm值）建立纵坐标，通过Origin 软件拟合标准曲线，结果见图5。

由图可知，纳米金增强ELISA 的检测灵敏度（50%抑制浓度）为0.28 ng/mL，最低检测限（90%抑制浓度）为0.01 ng/mL，检测线性范围为0.01～10 ng/mL，而传统ELISA 的灵敏度和检测限分别为3.61 ng/mL 和0.1 ng/mL，检测线性范围为0.1～100 ng/mL，两种方法相比较，本研究所建立的纳米金增强ELISA 灵敏度提高了约13 倍，检测限和线性范围也均有提高。结果表明，由于金纳米颗粒自身的纳米酶特性加上其表面吸附的多个酶标二抗所共同表现出的强催化活性，使得纳米金增强ELISA 的检测灵敏度得以提高。

2.4 特异性

测定DON 及其结构类似物AFB1、T-2、ZEN 及OTA 的IC50，以DON mAb 对DON 的IC50与各竞争物的IC50之比的百分数为其交叉反应率（CR%）。以交叉反应率评价方法的特异性，交叉反应率越低，方法的特异性越高，结果见表3。与常见的其他类似物几乎没有交叉反应，证明该纳米金增强ELISA 方法的特异性良好。

表3 交叉反应率结果

2.5 样品的加标回收

将不同浓度的DON 标准品加入阴性面粉样品，用所建立的纳米金增强ELISA 方法测定面粉中DON 含量，结果见表4。研究发现，对加标范围在1～10 ng/mL 的面粉样品的回收率可达86.54%～107.34%，变异系数均低于8%，说明该方法的准确性、重复性良好。

表4 样品回收率测定结果分析

3 结语

本文成功建立了一种纳米金增强ELISA 用于DON 的检测，是通过简单的方法在纳米金表面负载ELISA 检测中常用的酶标二抗分子，从而得到更高活性的酶标二抗-纳米金复合物。该复合物具有更高催化活性，相较于传统的ELISA，方法的灵敏度可提高约13 倍，同时改善检测的准确性和重复性。该方法成本低、灵敏度高，也具有传统ELISA 可满足现场大批量检测的优点，可在质检机构、企业等基层单位推广，应用前景良好。