双氧化酶成熟因子2基因检测在肺癌患者淋巴结转移及预后预测中的价值研究

刘 丽，武愫斌

(1.陕西省第二人民医院病理科,陕西 西安 710005;2.商洛市中心医院胸心外科,陕西 商洛 726000)

肺癌是起源于肺部支气管黏膜或腺体的恶性肿瘤，是目前全球发病率第二高，病死率第一高的恶性肿瘤[1]。在中国，肺癌的发病率和病死率均是第一高的恶性肿瘤，并且随着我国工业化进程的不断进展，肺癌的发病率呈现逐年上升的趋势[2]。根据组织病理学特点不同，肺癌可分为非小细胞肺癌(Non-small cell lung cancer,NSCLC)和小细胞肺癌(Small cell lung cancer,SCLC)，其中NSCLC约占所有肺癌的80%，并且约75%的NSCLC初次诊出时已处于疾病中晚期，生存率较低[1-2]。此外，尽管随着医疗技术的不断发展，肺癌患者的生存率在近年来得到延长，然而由于肺癌的病因尚不明确，所以肺癌患者病死率极高。因此，研究肺癌发生发展的分子机制，探寻与肺癌患者预后有关的生物标志物对肺癌的临床治疗和提高患者预后意义重大。双氧化酶成熟因子2(Dioxygenase maturation factor 2,DUOXA2)是还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH)氧化酶蛋白家族的重要一员，被证实与人体甲状腺相关疾病有关[3-4]。近期，一项在结肠癌中的研究[5]表明，DUOXA2在结直肠癌肿瘤组织中表达升高，并且与结直肠癌患者淋巴结转移和不良预后有关。然而，目前尚无研究报道肺癌肿瘤组织中DUOXA2的表达情况，本研究收集90对肺癌肿瘤组织和癌旁正常组织标本，通过定量PCR、免疫印迹法和免疫组织化学法检测DUOXA2基因的表达，以研究DUOXA2基因在肺癌患者肿瘤组织中的表达及其临床意义。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2016年1月到2018年12月在我院外科进行手术的肺癌患者90例，其中男53例，女37例，年龄42～81岁，平均年龄(55.3±12.0)岁。病例纳入标准：①病理确诊为肺癌，且TNM分期为Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ期；②组织标本采集前未接受化疗、放疗以及生物靶向治疗；③年龄不小于18周岁；④年龄、性别、吸烟史以及临床病理特征资料完整。排除标准：①合并其他恶性肿瘤；②心、肝或肾脏功能异常；③妊娠期或哺乳期妇女；④吸毒或合并其他传染性疾病患者。所有参与本次研究的患者均对本次研究知情，并签订知情同意书。

1.2 定量PCR法检测DUOXA2 mRNA表达 使用组织/细胞总RNA提取试剂盒(XY1061R，上海信裕生物科技有限公司)提取组织的总RNA。然后使用cDNA逆转录合成试剂盒(BLJM9003120，北京杰美生物科技有限公司)合成cDNA，最后根据荧光定量PCR试剂盒(BL705A，Yojanbio)说明书准备定量PCR反应体系并使用荧光定量PCR仪(FQD-96A，BIOBASE)进行分析。定量PCR反应条件：95 ℃、5 min，40个循环(95 ℃、30 s，65 ℃、30 s)。PCR引物如下：DUOXA2-F:5’-TCGTAATGATACCCAGAACATAGACA-3’;DUOXA2-R:5’-TTTGCTCCTAGAGGAACCATGGTA-3’。

1.3 免疫印迹法检测DUOXA2蛋白表达 使用RIPA裂解液(R0010，Solarbio，中国)从细胞中提取总蛋白，然后使用BCA试剂盒(C503021，Sangon Biotech，中国)检测总蛋白质的浓度。最后，在90 V恒定电压下，通过10%SDS-PAGE分离50 μg总蛋白。将蛋白从SDS-PAGE凝胶转移到PVDF膜上，5%脱脂牛奶室温封闭1 h。将膜与一抗(抗DUOXA2抗体)(ab230209，abcam，UK)在4 ℃孵育过夜后在室温下孵育二抗2 h。

1.4 免疫组织化学法检测DUOXA2蛋白表达 免疫组织化学法检测肺癌肿瘤组织或癌旁正常组织蛋白表达选用VECTASTAIN®Elite®ABC Kit(Vector Laboratories，美国)进行，具体检测步骤参照说明书进行。最后，每张切片选择5个视野拍照，并进行评分：DUOXA2表达在细胞浆，未显色、黄色、棕黄色以及棕褐色分别记0分、1分、2分和3分；阳性细胞<5%、5%～25%、25%～50%、50%～75%以及>75%分别记0分、1分、2分、3分和4分。DUOXA2肺癌肿瘤组织及癌旁正常组织表达的免疫组织化学评分=颜色评分×阳性细胞评分。

2 结 果

2.1 DUOXA2在肺癌肿瘤组织中的表达 见表1。DUOXA2 mRNA 在90例肺癌肿瘤组织中的表达水平高于其在癌旁正常组织中的表达水平，DUOXA蛋白在90例肺癌肿瘤组织中的表达水平高于其在癌旁正常组织中的表达水平，差异均具有统计学意义(均P<0.05)。

表1 DUOXA2 mRNA和蛋白在肺癌肿瘤组织和癌旁正常组织中的表达比较

2.2 DUOXA2蛋白表达与肺癌患者临床病理学参数的相关性 见表2。DUOXA2蛋白在肺癌肿瘤组织中的表达水平与年龄、性别、病理类型、肿瘤大小和TNM分期无关(均P<0.05)，而与淋巴结是否转移有关(P<0.05)。

表2 DUOXA2蛋白表达与肺癌患者临床病理学参数的相关性

2.3 DUOXA2表达在不同淋巴结转移状态肺癌肿瘤组织中的表达比较 见表3。30例淋巴结转移肺癌患者肿瘤组织中DUOXA2 mRNA和蛋白表达均高于60例淋巴结未转移肺癌患者肿瘤组织中DUOXA2 mRNA和蛋白的表达，差异具有统计学意义(均P<0.05)。

表3 不同淋巴结转移状态肺癌肿瘤组织中DUOXA2表达比较

2.4 DUOXA2表达与肺癌患者预后相关性分析 见表4。多因素回归分析显示，90例肺癌患者预后与肺癌患者年龄、性别和肿瘤分化程度无关(P>0.05)，而肿瘤直径、淋巴结转移、TNM分期和DUOXA2表达水平与肺癌患者预后有关(P<0.05)。

表4 肺癌患者预后多因素回归分析

3 讨 论

2020年中国新发癌症中，男性肺癌新发病例539 181例，占男性癌症新发病例比例为31.4%；女性肺癌新发病例276 382例，占女性癌症新发病例比例为22.2%。研究[6-7]发现，80%的肺癌患者为非小细胞肺癌，而约75%非小细胞肺癌患者在初次确诊时已处于中晚期，5年生存率为17.6%，而早期肺癌患者经手术切除治疗后的5年生存率高达80%以上，但仍存在一部分早期肺癌患者预后不良，这可能与恶性肿瘤的异质性特征有关。

本研究通过定量PCR法检测DUOXA2 mRNA在肺癌组织和癌旁正常组织中的表达，通过免疫印迹法和免疫组织化学法检测DUOXA2蛋白在肺癌组织和癌旁正常组织中的表达，结果显示：DUOXA2基因在肺癌组织中的表达水平显著高于其在癌旁正常组织的表达水平，这一结果与张雪等[5]的研究结果一致。张雪等[5]研究发现，DUOXA2基因在75例结肠癌组织中的表达水平显著高于其在癌旁正常组织中的表达，提示DUOXA2可能参与结直肠癌的发生发展。DUOXA2是NADPH氧化酶蛋白家族的重要成员，其作为DUOX2的激活蛋白，与DUOX2一起可形成决定H2O2生成的复合物[8-9]。近年来，关于DUOX2在肿瘤发生发展的研究越来越多，比如Zhang等[10]研究发现，DUOX2可通过调节AKT信号通路和与RPL3相互作用而促进结直肠癌的进展；Burgueno等[11]的研究则表明，通过激活DUOX2可诱导微生物驱动肿瘤的发生。

近年来随着测序技术的不断进步和生物信息学分析技术的飞速发展，多个与肺癌细胞迁移有关的分子被鉴定出[12-13]。本文研究发现，DUOXA2基因在淋巴结转移的肺癌患者肿瘤组织中的表达水平显著高于淋巴结未转移的肺癌患者，表明DUOXA2可能与肺癌细胞的转移有关，这一结果Cao等[14]的研究结果一致。Cao等[14]通过检测胰腺癌细胞和组织中DUOX2蛋白的表达发现，DUOX2蛋白在胰腺癌细胞和组织中表达升高，并且DUOX2被激活后可促进胰腺癌细胞的迁移，而DUOXA2是DUOX2特异性的激活蛋白。此外，本文研究还发现，DUOXA2蛋白是影响肺癌患者预后的独立危险因素(P=0.039，95%CI：1.329～5.039)。肿瘤微环境在肿瘤发生发展过程中发挥重要作用，而长期处于氧化应激环境中的细胞会引起其内的信号通路异常传导，这种信号通路的异常传导可以促进癌症的进展[15-16]。DUOXA2和DUOX2形成的复合物是H2O2生成的决定因子，而H2O2的增加是恶性肿瘤细胞的主要特征之一[17-18]。H2O2生成的增加不仅会增强肿瘤微环境的氧化应激状态，而且可以通过损伤细胞DNA而促进癌症的进展[19-20]。

综上所述，DUOXA2基因在肺癌肿瘤组织中表达升高，并且其表达与肺癌细胞的淋巴结转移有关，其是影响肺癌患者预后的独立危险因素，可能在肺癌的发生发展中发挥作用，但尚需进一步研究证实。