新型材料聚醚F127二丙烯酸酯对纤维环损伤的修复作用

王 瀚，王勤三，和 宇，张钦翔，王 迪，毛建鑫，杨 柳，罗卓荆

(空军军医大学： 1全军骨科研究所，西京医院骨科， 3基础医学院学员队，陕西 西安710032； 2空军特色医学中心骨科，北京 100142)

椎间盘是脊柱中的重要结构，具有承载与缓冲脊柱应力的功能，确保脊柱的正常生理活动。然而，衰老、异常应力与损伤等原因，会导致椎间盘的退变。其具体表现为髓核的含水量降低，进而减弱髓核组织的弹性。此外，过载应力的积累导致纤维环结构的疲劳损伤，进而导致纤维环的破损[1]，最终导致椎间盘破裂、髓核组织疝出，对周围的脊髓或神经根造成压迫而产生疼痛、麻木、肢体瘫痪、大小便障碍等严重症状。所以，修复破损的纤维环是椎间盘退变治疗的关键环节[2]。然而在目前的临床实践中，尚未找到满意的修复纤维环的治疗方法。椎间盘严重退变时，往往只能通过刮除破损的纤维环及其他椎间盘组织并对该节段植骨融合治疗，降低脊柱原有的活动度。对于轻度椎间盘退变伴有纤维环损伤、髓核疝出者，目前的纤维环封堵器在术后1年复发率可达3%～8%，而术后5年的复发率可达18.8%[3-4]。所以，能否找到一种更有效的纤维环修复重建方法是脊柱领域研究的重点问题。

组织工程技术是一种极具转化前景的组织修复方法，也是目前再生医学的研究前沿。已有许多研究尝试使用组织工程技术修复纤维环损伤。胶原胶与纤维蛋白胶等生物材料因其良好的生物相容性被用于修复纤维环损伤，但具有力学强度不足的劣势[5-6]。能否进一步发现一种更适用于纤维环修复重建的组织工程材料，亟待进一步研究。

聚醚F127二丙烯酸酯(polyether F127 diacrylate, F127DA)是一种广泛用于生物医学领域的新型材料，具有高组织相容性和生物安全性，可与生物组织良好地交联、愈合。此外，还可在光引发剂作用下快速与交联固化成胶，非常契合纤维环修复的临床应用场景。更重要的是，F127DA的力学性质良好，可以承载较大应力，适应纤维环生理状态下的力学环境。基于此，本研究拟使用F127DA修复纤维环缺损，对修复后的纤维环进行多方面检测，观察修复效果，以评估F127DA材料在椎间盘纤维环修复重建领域中的应用前景。

1 材料与方法

1.1 材料

F127DA水凝胶(EFL公司，中国)；苯基(2,4,6-三甲基苯甲酰基)磷酸锂盐(lithium phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate, LAP)光引发剂(EFL公司，中国)；40 mL/L多聚甲醛固定液、EDTA脱钙液、番红固绿染液(索莱宝公司，中国)。场发射扫描电镜(Hitachi公司，日本)，生物力学检测仪(Bose公司，美国)。

健康雄性C57BL/6J小鼠(2月龄)，由空军军医大学动物实验中心提供。所有实验程序均经空军军医大学动物伦理研究委员会批准(许可证号：20200526)。

1.2 方法

1.2.1 F127DA的配制 配制2.5 g/L LAP光引发剂标准溶液，在避光条件下以40～50 ℃水浴加热溶解15 min，期间振荡数次。以标准LAP光引发剂溶液配制150 g/L的F127DA溶液，室温溶解30 min，期间振荡数次，在4 ℃的条件下避光保存。

1.2.2 高浓度胶原胶(high-density collagen gel, HDC)的制备 取小鼠尾巴洗净、乙醇消毒，抽出尾腱。将尾腱剪断用PBS漂洗，将所有的尾腱浸于Tris-HCl中，4 ℃过夜。吸弃Tris-HCl，将鼠尾肌腱剪碎移入烧瓶，每克肌腱加入1 mL/L醋酸溶液50 mL，充分混匀，在4 ℃静置7 d，待其充分溶解。以4 000 r/min的转速4 ℃离心30 min；取上清液，用300目滤器过筛；每 60 mL上述粗提液中加入0.14 mol/L NaOH溶液10 mL，8 000 r/min离心5 min，弃上清液。将絮状沉淀冻干，溶解于0.1 mol/L醋酸溶液。调整浓度为20 g/L，制成HDC溶液。

1.2.3 小鼠纤维环损伤模型的制作 将24只雄性C57BL/6J小鼠(2月龄)随机分为4组：对照组、纤维环损伤组、HDC修复组与F127DA修复组，每组6只。腹腔注射100 mL/L水合氯醛溶液对小鼠进行麻醉，待麻醉生效后在鼠尾部绑扎橡皮筋止血带。通过尾根定位确定C3～C8椎间盘的体表位置。乙醇消毒，沿小鼠尾部背侧中央纵行切开C3～C8椎间盘对应的皮肤，约3～4 cm。钝性分离尾部肌肉及韧带，暴露椎间盘。用尖刀在纤维环上制造长方形缺损，深度约1 mm，尽量达到纤维环全层但不累及髓核。单纯损伤组在纤维环缺损处滴入生理盐水；HDC组滴入HDC溶液，用灯泡靠近加热以促进成胶；F127DA组滴入配置好的F127DA溶液，并用405 nm的蓝光照射40～60 s，使水凝胶固化。缝合伤口，去除止血带，乙醇消毒伤口。4周后对小鼠进行取材，完成后续检测。

1.2.4 扫描电镜 将F127DA水凝胶与HDC水凝胶冻干，在冷冻条件下用真空溅射仪进行断裂，露出样品新鲜的断裂面，并在表面喷金。通过冷冻传输系统将制作好的样品置于扫描电镜的冷台观察其纤维结构。

1.2.5 生物力学检测 对各组水凝胶与椎间盘纤维环样本进行压缩力学检测。压缩试验中加载速度设置为0.02 mm/s。在每个样本的相同部位施加负荷。记录载荷和变形数据，并在50 Hz下采样。利用载荷-挠度曲线计算样本的最大载荷(N)和弹性模量(Gpa)。

1.2.6 番红固绿染色 将各组样本的石蜡切片常规脱蜡至水，在配置的新鲜苏木精染液中染色 5 min，结束后在酸性乙醇分化液中分化15 s，用蒸馏水洗涤10 min，在苯胺固绿染色液中染色5 min，蒸馏水洗涤1 min，置入苯胺番红染色液中染色2 min，蒸馏水洗涤2 min，然后采用950 mL/L乙醇和无水乙醇脱水，二甲苯透明后封片、镜检。组织学图片采用国际通用的椎间盘组织学评分系统进行评估[7]。

2 结果

2.1 F127DA水凝胶的表征

F127DA水凝胶经405 nm波长的蓝光照射后，可固化成胶，所形成的水凝胶具有较高的力学强度，并在约200%的拉伸状态下仍能保持结构完整(图1)。通过扫描电镜观察水凝胶的微观形貌可以发现，相比于传统纤维环修复材料HDC，F127DA水凝胶具有更紧密的空隙结构，孔径较小，且排列具有方向性(图2)。以上结构特点均决定了F127DA水凝胶具有更强的力学性质。

A：自然状态；B：拉伸状态。图1 F127DA水凝胶的抗拉伸性能

A：F127DA水凝胶；B：HDC水凝胶。标尺为100 μm。图2 扫描电镜显示水凝胶的微观形貌

2.2 F127DA水凝胶的力学性质

将F127DA与HDC水凝胶分别制成高度和直径均为10 mm的圆柱体，并使用力学检测仪对其进行压缩试验。结果发现，在压缩量达到1.86 mm时，HDC水凝胶进入非弹性形变的强化状态，此时承载的压力为1.71 N；而在压缩量达到2.3 mm时，HDC水凝胶发生破裂，此时承载的最大压力为2.78 N。F127DA水凝胶在4 mm压缩的全过程中均保持了弹性形变，期间最大承载的压力为4.39 N(图3)。表明F127DA水凝胶的抗压缩能力强于HDC水凝胶。

图3 F127DA水凝胶与HDC水凝胶的载荷-形变曲线

2.3 F127DA水凝胶对纤维环损伤的修复作用

我们分别将F127DA与HDC水凝胶滴入纤维环缺损小鼠模型并进行蓝光照射使水凝胶固化，在造模1个月后取材观察修复效果。通过番红固绿染色发现：纤维环损伤组椎间盘高度丢失、纤维环结构完全破坏、瘢痕组织填充；HDC修复组部分恢复纤维环的纤维成分，然而在修复区域存在空洞；F127DA修复组部分恢复纤维结构，在植入材料的外侧边缘仍存在部分空洞，而材料修复的内部纤维排列致密、无空洞(图4)。进一步纤维环组织学评分结构显示，纤维环损伤组组织学评分显著高于对照组[(7.9±0.9)分vs(0.2±0.2)分，P<0.01]，表明造模成功。F127DA修复组的评分(4.8±0.4)显著低于HDC修复组(5.7±0.6)与纤维环损伤组(7.9±0.9)(P<0.05)，表明F127DA水凝胶对纤维环的修复作用优于HDC水凝胶(图5)。

A：对照组；B：纤维环损伤组；C:HDC修复组；D：F127DA修复组。标尺为100 μm。图4 番红固绿染色显示不同水凝胶对纤维环的修复效果

HDC:高浓度胶原胶；F127DA：聚醚F127二丙烯酸酯。 aP<0.05, bP<0.01。图5 不同水凝胶修复纤维环的组织学评分

我们进一步将F127DA与HDC 水凝胶修复纤维环的修复区域取材进行生物力学检测，结果发现HDC修复组的修复区域在压缩量达到0.58 mm时出现了屈服现象，此时承受的压力为0.92 N；而F127DA修复组的修复区域在0.64 mm的压缩全程均处于弹性形变过程，最大承受压力为1.62 N(图6A)。进一步计算修复区域的弹性模量发现，F127DA修复组的弹性模量显著高于HDC修复组，表明F127DA水凝胶修复纤维环缺损后的力学性质优于传统修复材料HDC(图6B)。

A：纤维环修复区的载荷-形变曲线；B：纤维环修复区的弹性模量(aP<0.05)。HDC:高浓度胶原胶；F127DA：聚醚F127二丙烯酸酯。图6 纤维环的修复区域的载荷-形变曲线与弹性模量

3 讨论

在严重椎间盘退变时，纤维环会发生损伤甚至破裂，导致髓核突出进而压迫神经，引发疼痛、麻木、无力等一系列症状。因此，如何妥善修复纤维环是椎间盘退变治疗中的重要问题。然而，目前临床使用的纤维环修复方法，如纤维环直接缝合、射频消融或是纤维环缺损的封堵，均不能获得满意的远期疗效[8]。在上述方法的纤维环修复过程中，主要依靠纤维瘢痕愈合修复，其改变了原有的纤维环结构，致使力学性质改变，容易在急性暴力或应力积累的情况下再次破裂，从而导致疾病复发。组织工程技术可以通过种子细胞与材料支架填充纤维环缺损，诱导纤维环的生物愈合，从而达到原有纤维结构的重建与再生，是良好的纤维环修复方法。而材料支架是组织工程技术中的最重要环节，恰当使用生物材料不仅可以支撑细胞重塑、支持细胞间的信息传递，同时也能够帮助纤维环损伤的修复以及力学性能的恢复。本研究通过对纤维环修复材料的分析比较，尝试更适用于纤维环的修复材料，从而促进纤维环组织工程修复技术发展。

现有的组织工程修复纤维环的生物材料主要分为天然材料与人工合成材料。在天然材料中，京尼平交联的纤维蛋白制备支架并负载纤维环细胞用于纤维环修复，具有良好的生物相容性且其降解产物几乎无细胞毒性，但其力学性能较弱[9]；在人工合成材料中，多聚γ氨基戊二酸明胶水凝胶能与损伤的纤维环黏附，形成水凝胶网络，达到修复纤维环损伤的效果，但其力学强度较纤维环组织仍有差距，因此用于临床修复纤维环损伤仍不够理想[10]。在本研究中，首次使用F127DA修复纤维环损伤，验证了由于F127DA的力学特点可有效提高纤维环修复区域的力学强度，为纤维环的修复重建寻找到一种力学性质适配的修复材料。

F127DA在2015年首次被报道，是经过软性交联剂的原位共聚合而制成，具有高强度、高韧性和耐疲劳的新型水凝胶[11]，且它对于环境改变，如pH值、离子浓度等，具有出色的稳定性，能够保持结构的完整。该种水凝胶的强度高、韧性强、稳定性好的特点，还适用于药物输送、微器件搭载或组织修复等领域[12]。有研究将4-十二烷酰胺哌啶与F127DA混合并与丙烯酸接枝共聚，将交联到臭氧化硅酮表面，可有效抑制材料表面的细菌定殖。该方法可有效提高医疗器械表面的抗菌能力[11]。此外，在组织修复方面，由F127DA、聚乙二醇双丙烯酸酯、改性海藻酸钠和单宁酸组成的新型无溶胀水凝胶黏合剂可以用于伤口覆盖并促进其愈合，与传统方法相比，具有便捷、抑菌、生物愈合良好等优势[13]。还有研究将其用于软骨修复，在兔喉甲状软骨损伤模型中，F127DA纳米胶束交联甲基丙烯酸透明质酸水凝胶能有效促进软骨再生，并保持良好的刚度、韧性和弹性[14]。此外，还有研究采用3D打印技术将海藻酸钠与F127DA结合，制备具有内部结构的形状记忆水凝胶，从而获得良好的药物控释作用，在药物载体和组织工程支架方面具有广阔的应用前景[15]。在本研究中，根据前期研究已发现的F127DA力学强度高、耐疲劳等特点，我们首次尝试将其用于纤维环修复。经组织学与生物力学检测,其修复效果优于传统材料，提示F127DA是一种适用于纤维环的修复材料，研究拓展了F127DA的应用领域。

综上所述，本研究首次验证了F127DA水凝胶对纤维环损伤具有良好的修复效果，可使纤维环修复区域具有较高的力学强度与韧性，能够有效恢复纤维环的力学功能，预防纤维环损伤的复发，为纤维环损伤临床治疗新方法的研究提供了实验依据。