岩黄连总碱对牙龈卟啉单胞菌的体外抑菌活性研究▲

叶文丽 雍翔智# 吴恬恬 廖海清 苏志恒 陶人川*

1 广西壮族自治区卫生健康委员会口腔感染性疾病防治重点实验室，南宁市 530000；2 广西医科大学药学院，南宁市 530000

慢性牙周炎是全球第6大流行疾病，全球患病人数约达7.43亿人，总发病率为11.2%，该病可严重降低患者的生活质量[1]。牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonasgingivalis,P.gingivalis)是一种革兰氏阴性厌氧菌，是牙周炎的主要致病菌，可局部入侵牙周组织，逃避宿主防御机制，表达多种毒力因子削弱机体免疫系统，破坏牙周组织[2]。因此，清除和控制P.gingivalis等口腔致病菌是临床治疗牙周炎的主要手段之一。

目前，局部或全身使用抗生素是临床常用的牙周炎辅助治疗方式，但长期使用抗生素会导致细菌出现耐药性[3-4]。岩黄连是一种多年生草本植物，是广西的特色中草药。研究表明岩黄连具有抗菌、抗炎、抗病毒和抗肿瘤等作用[5-8]。岩黄连总碱(CorydalissaxicolaBunting total alkaloids, CSBTA)是岩黄连的有效成分，主要由脱氢卡维丁、小檗碱、巴马汀组成[9]。目前，关于CSBTA对P.gingivalis是否具有抗菌活性尚未见报告，因此本研究初步探究CSBTA对P.gingivalis的体外抑菌效果。现将结果报告如下。

1 材料与方法

1.1 主要材料与设备P.gingivalisATCC 33277菌株购自广东省菌种保藏中心。CSBTA由广西医科大学药学院药物分析教研室提供。胰蛋白胨大豆肉汤(tryptic soy broth, TSB)培养基，氯化血红素，维生素K1，哥伦比亚血琼脂平板，革兰氏染色试剂盒，恒温厌氧培养箱YQX-Ⅱ(上海新苗，中国)，酶标仪Infinite 200pro(TECAN，瑞士)。

1.2 研究方法

1.2.1 菌种的复苏和培养 将冻存于-80 ℃冰箱的P.gingivalis菌种取出，菌种在常温环境下解冻后接种在哥伦比亚血琼脂平板上进行复苏，将平板倒置于80%氮气、10%二氧化碳、10%氢气，37℃恒温厌氧培养箱中培养5～7 d。待平板上形成形态均一的灰黑色菌落后，挑取若干单克隆菌落接种至TSB培养基中进行增菌培养。

1.2.2P.gingivalis的鉴定及其对数生长期的测定 细菌在37℃恒温厌氧培养箱中培养5 d，刮取适量细菌进行革兰氏染色后镜检，结合形态学等进行菌株鉴定，确认其为P.gingivalis后，取单克隆菌落接种至TSB培养基中，分别在0 h、4 h、8 h、12 h、16 h、20 h、24 h、32 h、40 h、48 h时各取200 μL菌液置于96孔板中，采用酶标仪在600 nm波长下测定光密度值(optical density, OD)，绘制生长曲线。

1.2.3 CSBTA对P.gingivalis的药物敏感性实验

1.2.3.1 不同浓度CSBTA溶液的配制 将CSBTA溶解于二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)溶液中，配制成20 g/L CSBTA溶液，再将其稀释为0.02 g/L、0.04 g/L、0.08 g/L、0.16 g/L、0.32 g/L、0.64 g/L CSBTA溶液备用。

1.2.3.2P.gingivalis菌悬液的制备 取适量P.gingivalis加入TSB培养基，在80%氮气、10%二氧化碳、10%氢气，37 ℃恒温厌氧培养箱中培养16 h。取对数生长期的菌液，用TSB培养基将菌液调整至0.5麦式比浊标准菌悬液(1.5×108CFU/mL)备用。

1.2.3.3 最小抑菌浓度和最小杀菌浓度的测定 将对数生长期P.gingivalis菌悬液(1.5×108CFU/mL)加入96孔板中(100 μL/孔)，分别加入0.02 g/L、0.04 g/L、0.08 g/L、0.16 g/L、0.32 g/L、0.64 g/L CSBTA溶液100 μL和DMSO溶液100 μL，每个浓度各设三个复孔。将该96孔板置于80%氮气、10%二氧化碳、10%氢气，37 ℃恒温厌氧培养箱培养48 h后，黑色背景下肉眼观察菌液无浑浊出现的最低药物浓度为最小抑菌浓度(minimal inhibitory concentration，MIC)。

分别取5 μL MIC以上的各组菌液点种于哥伦比亚血琼脂平板上，在37℃恒温厌氧培养箱中培养72 h后，抑制细菌明显增长(平板上菌落数为0)的最低药物浓度即为最小杀菌浓度(minimal bacteriocidal concentration，MBC)。以上实验重复三次。

1.2.4 CSBTA对P.gingivalis的相对生长抑制率的测定 将对数生长期P.gingivalis菌悬液(1.5×108CFU/mL)加入96孔板中(100 μL/孔) ，分别加入0.02 g/L、0.04 g/L、0.08 g/L、0.16 g/L、0.32 g/L、0.64 g/L CSBTA溶液100 μL作为实验组各设置三个复孔；另设置一孔加入DMSO溶液100 μL作为对照组，设三个复孔。在37℃恒温厌氧培养箱中培养48 h后，采用酶标仪测量600 nm波长下各孔OD，计算不同浓度CSBTA下P.gingivalis的相对生长抑制率。相对生长抑制率=[对照组OD增长值-实验组OD增长值]/对照组OD增长值×100%。以上实验重复三次。

1.2.5 CSBTA对P.gingivalis的生长曲线的影响 取相应浓度的CSBTA溶液(0.04 g/L、0.08 g/L、0.16 g/L)和对数生长期P.gingivalis菌悬液(1.5×108CFU/mL)各2.5 mL混合均匀，将CSBTA终浓度分别为1/4MIC、1/2MIC、MIC作为实验组；将DMSO溶液与对数生长期P.gingivalis菌悬液(1.5×108CFU/mL)各2.5 mL混合均匀后作为对照组。分别在0、4、8、12、16、20、24 h时各吸取200 μL菌液置于96孔板中，采用酶标仪测量600 nm波长下各孔OD，并绘制生长曲线。以上实验重复三次。

1.3 统计学处理 采用SPSS 23.0统计学软件进行数据分析。计量资料以x±s表示，多组间均数比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD法或Dunnett T3法。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1P.gingivalis的鉴定及其对数生长期的测定 经革兰氏染色镜检显示，P.gingivalis在镜下呈红色，为革兰氏阴性菌。P.gingivalis在培养4～20 h时处于对数生长期，细菌快速增殖，20 h后细菌增殖逐渐进入平台期，细菌生长较为缓慢。见图1和图2。

图1 P.gingivalis革兰氏染色(100×)

图2 48 h内P.gingivalis正常生长曲线

2.2 CSBTA对P.gingivalis的药物敏感性实验 经48 h的厌氧培养后，0.08 g/L、0.16 g/L、0.32 g/L CSBTA下的菌液均无浑浊出现，故CSBTA对P.gingivalis的MIC为0.08 g/L。选择0.08 g/L、0.16 g/L和 0.32 g/L CSBTA溶液进行MBC测定，结果显示CSBTA对P.gingivalis的MBC为0.16 g/L。见图3。

图3 CSBTA对P.gingivalis的MBC测定

2.3 CSBTA对P.gingivalis的相对生长抑制率的测定 不同浓度(0.01 g/L、0.02 g/L、0.04 g/L、0.08 g/L、0.16 g/L、0.32 g/L)CSBTA对P.gingivalis的相对生长抑制率差异有统计学意义(P<0.05)。CSBTA浓度为0.02 g/L时，50%以上细菌生长受到抑制；CSBTA浓度为0.08 g/L时，90%以上细菌生长受到抑制。见表1和图4。

表1 不同浓度CSBTA对P.gingivalis的相对生长抑制率 (x±s)

图4 不同浓度CSBTA对P.gingivalis 的相对生长抑制率(与0 g/L CSBTA处理时比较，*P<0.05)

2.4 CSBTA对P.gingivalis生长曲线的影响 与对照组相比，各浓度CSBTA实验组对P.gingivalis生长均有不同程度的抑制，且呈浓度依赖性。0.02 g/L、0.04 g/L组细菌生长呈缓慢增长趋势，而0.08 g/L组P.gingivalis增长几乎完全受到抑制。见图5。

图5 24 h内不同浓度CSBTA对P.gingivalis生长的影响

3 讨 论

牙周炎是一种由细菌引起的炎症性疾病，可累及牙周结缔组织和牙槽骨等支持组织，引起牙齿松动、脱落[10]。P.gingivalis是牙周炎致病菌，能够在牙周组织定植，并通过产生多种毒力因子降低宿主的免疫防御能力[11-12]，破坏牙周微环境平衡，造成牙周组织破坏。此外，P.gingivalis参与了牙菌斑生物膜的形成，而牙菌斑生物膜使得P.gingivalis具有更高的致病力，使其对抗生素的耐药性更强[13-16]。

目前，临床上牙周炎的主要治疗方法是通过机械手段去除牙菌斑，如果患者合并局部感染状态，则应用抗生素进行辅助治疗，但长期应用抗生素可导致细菌耐药等问题的发生。近年来，关于抗P.gingivalis天然药物成分的开发与应用的研究已取得了一些进展。体外研究[17-18]表明，天然药物成分白藜芦醇和姜黄素对P.gingivalis的生长及其部分毒力因子的表达均具有显著的抑制作用。Tsou等[19]的研究显示，咖啡中的绿原酸对P.gingivalis具有抑制和杀灭作用并且能够降低P.gingivalis相关蛋白酶活性。Yoshimasu等[20]报告，天然药物蜂胶能够通过增加P.gingivalis膜通透性诱导其死亡。岩黄连作为一种特色天然中草药，其有效成分CSBTA对金黄色葡萄球菌、化脓性链球菌、大肠埃希菌、福氏志贺菌等多种常见的革兰氏阳性菌和阴性菌均有抑制作用[21-22]。本课题组前期研究发现CSBTA能够有效地抑制THP-1来源的巨噬细胞M1极化和焦亡，减少炎症因子白细胞介素-1β、白细胞介素-6、肿瘤坏死因子-α的表达[23]。本研究立足于广西特色天然药物岩黄连，结合课题组前期研究探索CSBTA对P.gingivalis的体外抑菌作用。

本研究结果显示，P.gingivalis在培养4～20 h时处于对数生长期。故本研究绘制培养24 h内不同浓度CSBTA 下P.gingivalis的生长曲线，观察其对P.gingivalis的抑制作用。本研究结果显示，0.02 g/L、0.04 g/L CSBTA作用下P.gingivalis生长呈缓慢增长趋势，而0.08 g/L CSBTA作用下P.gingivalis生长几乎完全受到抑制，且CSBTA对P.gingivalis生长抑制具有明显的浓度依赖性。以上结果提示CSBTA对P.gingivalis的体外生长具有较强的抑制作用，且CSBTA浓度越高，抑制作用越强。本研究确定了CSBTA对P.gingivalis的MIC(0.08 g/L)与MBC(0.16 g/L)，在MIC浓度下超过90%的P.gingivalis生长受到抑制，在MBC以上浓度的哥伦比亚血琼脂平板上无细菌菌落形成。

目前在临床上，以CSBTA为主要成分的岩黄连注射液已被广泛用于治疗急慢性病毒性肝炎、肝癌、直肠癌等疾病。本研究结果发现CSBTA对P.gingivalis的MIC为0.08 g/L，MBC为0.16 g/L，均远低于临床使用的岩黄连注射液中CSBTA含量(0.35 g/L)，故使用MIC或MBC治疗牙周炎可能有较高的生物安全性。

综上所述，CSBTA对P.gingivalis具有较强的体外抑菌活性与较高的生物安全性，有望成为新型的牙周炎辅助治疗药物。