基于UPLC-QTOF MS的鱼类鳃靶器官代谢组学分析方法研究
2022-08-17刘英杰姚明珠李姗蔚陈中祥孙言春
刘英杰,姚明珠,李姗蔚,陈中祥,王 鹏,孙言春*
(1.上海海洋大学 食品学院,上海 201306;2.中国水产科学研究院 黑龙江水产研究所,黑龙江 哈尔滨 150010)
代谢组学是研究生物体系受到外部刺激或扰动后内源性代谢物的整体改变及变化规律的一门科学[1]。作为系统生物学的重要组成部分,随着高通量高分辨率分析技术的不断成熟,代谢组学发展迅速,现已在药物毒理、临床疾病及食品营养等领域得到了广泛应用。由于代谢组学可以揭示生物系统在细胞层面的变化规律,从整体上阐明特定性状发生发展的物质基础和调控机制,因此为包括水生动物在内的良种繁育以及抗逆应激机制研究提供了一种新的有效手段。近年来,代谢组学技术在水产科学中的研究备受关注[2-5]。
目前,代谢组学常用的分析技术主要包括液相色谱-质谱联用[6-7]、气相色谱-质谱联用(GCMS)[8-9]、核磁共振(NMR)[10-11]等。其中,以超高效液相色谱-三重四极杆飞行时间质谱(UPLCQTOF MS)为代表的液相色谱-质谱联用技术因高灵敏度、高通量、高特异性、高分辨率和扫描速度等特点已成为代谢组学分析的重要手段。就分析步骤而言,常规的代谢组学实验流程主要包括样本的收集和前处理、代谢组数据的采集、数据预处理、数据统计分析、标志物识别和通路分析等。由于生物样品中所含物质种类丰富,而其中代谢物的丰度和极性呈现高度差异性,因此,规范的样本前处理与数据采集方法在提高代谢物数据的覆盖率、准确性、稳定性过程中起着决定性的作用[12]。
作为鱼类参与呼吸、离子和渗透调节、酸碱平衡和氨氮排泄的主要功能器官,鳃与周围水环境有着直接和持续的相互作用,在环境适应、应激下的生理调控中扮演着重要角色[13]。由于鳃组织中的代谢物具有种类繁多、化学结构多样、极性差异较大等特点,因而对其代谢组学的全面分析提出了巨大挑战。目前,虽有一些研究对血清[14]、血浆[15]、肾脏[16]、胚胎[17]等样品的代谢组学分析方法进行了探讨,但仍然缺乏对于鳃这一水生动物特定器官的代谢组学分析优化方案。鳃代谢组学前处理以及数据采集的各方法中,尚未达到更好的覆盖范围和稳定性。因此,亟需建立一种适用于鳃样品的代谢组学分析方法,用于解析鳃靶器官在鱼类生物功能中的科学内涵。
本研究采用UPLC-QTOF MS 技术作为分析手段,利用蛋白质沉淀法对鲫鳃组织样品中的代谢物进行提取,通过反相C18色谱柱对代谢物进行色谱分离,并以葡萄糖、L-亮氨酸、柠檬酸、8-羟基二十碳四烯酸(8-HETE)、溶血磷脂酰胆碱(18∶0)(LysoPC(18∶0))、尿苷6 种不同极性的代表性内源代谢物为研究对象,以代谢物的覆盖率、稳定性为指标,结合质量控制(QC)样本评价方法,建立了适用于鱼鳃靶器官中小分子代谢物全面分析的代谢组学分析方法。该方法对鳃组织样品中广极性代谢物的覆盖面宽,具有提取率高、稳定性强、专属性强、灵敏度高等特点,适用于开展鱼类代谢组学研究。
1 实验部分
1.1 仪器与试剂
ACQUITY UPLC 超高效液相色谱仪(美国Waters 公司);SCIEX Triple TOF 5600 plus 高分辨质谱仪(美国AB SCIEX公司);Allegra X-30R高速离心机(美国Beckman公司);高通量组织研磨机(宁波新芝生物有限公司);涡旋混匀器(德国IKA公司);数控超声仪(昆山超声仪器有限公司);XS205DY电子天平(瑞士Mettler Toledo 公司);YP-2002 电子天平(上海越平公司);Milli-Q A10 超纯水机(美国Millipore公司)。
甲醇(MeOH)、乙腈(ACN)(质谱纯,德国Merck 公司);甲酸(色谱纯,德国Merck 公司);0.22µm 有机相滤膜(上海安谱公司);间氨基苯甲酸乙酯甲磺酸盐(MS-222)(美国Sigma-Aldrich 公司);生理盐水(四川科伦药业公司)。
1.2 实验方法
1.2.1 实验动物与样品采集本实验所用银鲫取自哈尔滨市方正县方正银鲫国家良种场。选择大小均一、健康无外伤且遗传背景一致的银鲫50 尾,体长约(13.0±0.5)cm,质量约(120.10±5.64)g,将其转移至室内温控循环养殖设备中。每天保持12 ~14 h 的光照,水温23 ~24 ℃,按照三定三巡(定时定点定量投喂、早中晚巡查)的管理模式驯养15 d。采样前24 h 停止喂食,将鱼转移至100 mg/L 的MS-222 溶液中深度麻醉后置于冰上解剖,快速采集鳃组织,用生理盐水清洗表面血液后立即置于冻存管中液氮速冻,之后转移至-80 ℃冰箱保存。
1.2.2 样品预处理取出-80 ℃下保存的鳃组织样品于4 ℃下解冻,准确称取50 mg于1.5 mL离心管中,加入800µL的4 ℃预冷甲醇-水(4∶1)和3个小钢珠,-20 ℃下以60 Hz的速度低温研磨3 min,于-20 ℃静置30 min后,在4 ℃下以13000 r/min离心15 min,取500µL上层溶液,经0.22µm有机滤膜过滤至进样瓶中待测。在此过程中,将所有样品等量混合制备QC样品,用于方法学考察。
1.2.3 UPLC-QTOF MS检测采用Waters Acquity UPLC BEH C18色谱柱(100 mm×2.1 mm,1.7µm),流动相A 为0.1%甲酸水溶液,流动相B 为0.1%甲酸乙腈溶液,流速为0.30 mL/min。洗脱梯度:0 ~2 min,5%~20%B;2~3 min,20%~60%B;3 ~11 min,60%~80%B;11 ~12 min,80%~100%B;12 ~13 min,100%B;13 ~13.1 min,100%~5%B;13.1 ~15 min,5%B。柱温为35 ℃,自动进样室温度为4 ℃,进样量为10µL。
离子源采用电喷雾(ESI)源,在正、负离子模式下扫描数据。TOF MS Scan 模式m/z范围为100 ~1200 Da;离子源温度:550 ℃;离子化电压:5500 V/-4500 V(正/负离子模式);气帘气(CUR):241.3 kPa;喷雾气(GAS):344.7 kPa;去簇电压(DP):80 eV;碰撞能量(CE):10 eV。信息依赖采集(IDA)法进行二级质谱数据采集的m/z范围为50 ~1200 Da,开启动态背景扣除(DBS),DP:80 eV;CE:(35±15)eV。每隔5个样品采集1次QC样品,以评估数据质量。
1.2.4 数据处理将正、负离子模式下采集的数据导入数据处理软件Progenesis QI(美国Waters 公司),对色谱峰进行谱峰识别、峰对齐、峰过滤等数据预处理程序。随后,使用HMDB(http://www.hmdb.ca/)与LIPID MAPS(https://www.lipidmaps.org/)公共数据库对代谢物进行注释。最后输出由保留时间、精确质荷比、样本名称、代谢物名称和峰面积组成的数据矩阵,导入多变量统计软件SIMCA 14.1进行主成分分析(PCA)。
2 结果与讨论
2.1 样品前处理方法的优化
代谢物的提取质量是影响代谢组学分析的关键因素,因而样品前处理步骤至关重要。在动物的代谢组学分析中,代谢物种类繁多,且不同代谢物之间的化学性质差异大。提取过程中必须兼顾不同代谢物的理化性质,尽可能高质量地获得样本中代谢物的全部信息。提取溶剂的种类、用量以及提取温度等关键参数会对代谢物的提取结果产生影响,因此本研究对上述参数进行了优化。
2.1.1 提取溶剂种类的选择代谢组学分析中,不同种类的提取溶剂对代谢物的极性选择范围不同。因此,提取溶剂种类是影响内源性代谢物的数量、种类和信号强度的主要因素之一[18]。以图谱总峰面积、检测到的代谢物数目、相对峰面积的相对标准偏差(RSD)以及代表性代谢物的信号强度为指标,考察了MeOH、ACN、MeOH-ACN(1∶1,体积比,下同)、MeOH-H2O(4∶1)、MeOH-H2O(7∶3)5 种提取溶剂的提取效果。
首先,将正、负离子模式下获得的UPLC-QTOF MS 原始数据导入Progenesis QI 软件进行数据预处理,得到不同提取溶剂下检测的总峰面积。结果如图1A所示,采用MeOH-H2O(4∶1)提取处理后,鳃组织样品经UPLC-QTOF MS检测的图谱总峰面积最大,且与除MeOH-H2O(7∶3)以外的3种提取溶剂之间存在显著差异。随后,使用公共数据库对代谢物进行注释,并计算各代谢物在不同样本间相对峰面积的RSD,以考察不同提取溶剂的平行性。结果如图1B 所示,采用MeOH、ACN、MeOH-ACN(1∶1)、MeOH-H2O(4∶1)、MeOH-H2O(7∶3)为提取溶剂分别鉴定出528、564、513、598和581种代谢物。在代谢组学分析中,代谢物的相对峰面积RSD <30%时,表明其特征较稳定[19]。相较而言,采用MeOH-H2O(4∶1)作为提取溶剂获得的代谢物数目最多,覆盖率最大,且相对峰面积RSD <30%的代谢物占比最大。选取葡萄糖、L-亮氨酸、柠檬酸等6种代表性内源代谢物,进一步考察了碳水化合物、氨基酸、甘油酯、有机酸等不同种类与极性的代谢物采用上述提取溶剂时的信号强度。结果如图1C所示,除LysoPC(18∶0)外,其余代表性代谢物采用MeOH-H2O(4∶1)为提取溶剂可获得更高的相对信号强度。综上,本研究最终选择MeOH-H2O(4∶1)作为提取溶剂。
图1 提取溶剂种类对鳃代谢物提取结果的影响Fig.1 The influence of extraction solvent type on the extraction results of gill metabolitesA. total peak area of TIC;B. the number of metabolites and RSD distribution;C. relative signal abundance of representative metabolites with different polarities;different letters in Fig.1A indicate significant differences among the treatment groups(p <0.05)
2.1.2 提取溶剂用量的选择提取溶剂的用量直接影响样品中蛋白质的去除效果和小分子代谢物的溶出效率,参考相关文献[20-22],本实验考察了样品-试剂比(mg∶µL)分别为1∶13、1∶16、1∶20 和1∶25时对鳃组织中代谢物提取效果的影响。
结果表明,样品-试剂比(mg∶µL)为1∶16 时获得的图谱总峰面积最大,且与1∶20 和1∶25 两组之间存在显著差异(图2A)。样品-试剂比为1∶13、1∶16、1∶20 和1∶25 时分别鉴定出564、580、497 和472 种代谢物,其中样品-试剂比为1∶16 时获得的代谢物数量最多,且相对峰面积RSD <30%的代谢物占比最大,稳定性良好(图2B)。进一步考察了6 种代谢物在上述样品-试剂比例下的信号强度,结果显示,各代谢物在样品-试剂比为1∶16 时的相对信号强度更高(图2C)。综上,本研究最终选择样品-试剂比(mg∶µL)为1∶16。
图2 提取溶剂用量对鳃代谢物提取结果的影响Fig.2 The influence of extraction solvent amount on the extraction results of gill metabolitesA. total peak area of TIC;B. the number of metabolites and RSD distribution;C. relative signal abundance of representative metabolites with different polarities;different letters in Fig.2A indicate significant differences among the treatment groups(p <0.05)
2.1.3 提取温度的选择在代谢组学样品前处理过程中,提取温度显著影响小分子代谢物的提取效果。提取温度过高可能影响蛋白质的沉淀效果,并导致代谢物降解。为进一步提高代谢物的提取效果,本研究对提取温度进行了优化。分别考察3 种不同方法对代谢物提取效果的影响:①鳃组织中加入常温(25 ℃)提取溶剂进行研磨;②鳃组织中加入4 ℃预冷后的提取溶剂进行常温研磨;③鳃组织中加入4 ℃预冷后的提取溶剂,在-20 ℃下进行低温研磨后,置于-20 ℃环境中静置30 min。
结果显示,采用方法③获得的图谱总峰面积最大,且与其它两种方法存在显著差异。就代谢物数目而言,上述3种提取条件下分别获得459、530、583种代谢物。采用方法③获得的代谢物数量最多,且相对峰面积RSD <30%的代谢物占比最大,体现出更好的稳定性。同时对6种代表性代谢物在不同提取温度下的信号强度进行了评估,结果显示,采用方法③时,6种代谢物均可获得最强的相对信号强度。
综上所述,最佳前处理方法为:样品-试剂比(mg∶µL)为1∶16,以4 ℃预冷的MeOH-H2O(4∶1)作为提取溶剂,在-20 ℃下进行低温研磨后,置于-20 ℃环境中静置30 min。
2.2 色谱与质谱条件的优化
2.2.1 色谱条件的优化采用Waters Acquity UPLC BEH C18色谱柱(100 mm ×2.1 mm,1.7µm),分别考察了流动相种类、柱温、流速、进样量等条件对色谱分离效果的影响。
为避免基质干扰,优化目标峰的保留时间,比较了甲醇-水、乙腈-水、0.1%甲酸甲醇-0.1%甲酸水、0.1%甲酸乙腈-0.1%甲酸水4种流动相对代谢物分离效果的影响。结果表明,流动相B为乙腈时代谢物的响应强度优于甲醇。而甲酸的加入有利于分析物形成[M+H]+,提高正离子检测模式下的离子化效率,同时可显著改善负离子检测模式下的色谱峰形,减少色谱峰拖尾。虽然酸性流动相对负离子检测模式下的信号强度略有抑制,但其减小程度不显著。因此本实验选择0.1%甲酸乙腈-0.1%甲酸水溶液作为流动相。
对柱温及流速的考察结果发现,柱温为35 ℃,流速为0.30 mL/min 时可获得较好的分离效果。对样品进样量的考察结果发现,增加进样量可提高代谢物的响应强度,但流动相系统的压力会有明显波动,导致干扰色谱峰无序出现,甚至影响目标色谱峰。最终,本实验选择最佳进样量为10µL。
2.2.2 质谱条件的优化UPLC-QTOF MS系统使用电喷雾离子源(ESI),为提高质谱响应强度及灵敏度,本实验选择前述6种代表性内源代谢物对离子源温度、离子源喷雾电压、气帘气、喷雾气、去簇电压、碰撞能量等质谱参数进行了优化,最终得到优化的质谱采集条件如“1.2.3”所示。
经色谱、质谱条件优化后,正、负离子模式下鳃组织样品中6种代谢物的总离子流色谱图(TIC)如图3所示。结果表明,各色谱峰的分离效果良好,响应值得到了显著提升。
图3 UPLC-QTOF MS分析获得的鳃组织代谢物总离子流色谱图Fig.3 Total ion chromatograms(TIC)of gill metabolites obtained by UPLC-QTOF MSA. positive ion mode;B. negative ion mode
2.3 方法学评价
2.3.1 仪器精密度按照优化后的样品前处理与仪器分析方法,对同一QC 样品连续进样6 次,进行UPLC-QTOF MS分析。表1结果显示,6种代表性代谢物相对峰面积的RSD为2.2%~4.2%,保留时间的RSD为1.2%~2.4%,表明仪器精密度良好。
2.3.2 方法精密度按照优化后的样品前处理与仪器分析方法,取6 份QC 平行样品,进行UPLCQTOF MS分析,并将获得的数据进行PCA分析。表1结果表明,6种代表性代谢物相对峰面积的RSD为3.4%~6.8%,保留时间的RSD为1.4%~4.6%。6个QC平行样本在正、负离子模式下的一维PCA图如图4A、4B所示,各样本的偏差均在2倍标准偏差(Std)范围内。取10份普通样品同时进行UPLC-QTOF MS分析,在正、负离子模式下获得的二维PCA 图如图4C、4D 所示,正、负离子模式下各QC 样本在小范围内表现出高度的聚集性。结果表明该方法的精密度和重复性良好。
表1 仪器精密度、方法精密度和样品稳定性实验结果(n=6)Table 1 Results of instrument precision,method precision and sample stability tests(n=6)
图4 QC样本的一维PCA图(A、B)与二维PCA图(C、D)Fig.4 One-dimensional PCA plots(A,B)and two-dimensional PCA plots(C,D)of QC samplesA,C:in positive ion mode;B,D:in negative ion mode
2.3.3 样品稳定性取同一QC 样品,分别在0、6、12、24、48、72 h,按照优化后的样品前处理与仪器分析方法进行UPLC-QTOF MS 分析。表1 结果表明,6 种代表性代谢物相对峰面积的RSD 为3.8%~10%,保留时间的RSD为3.4%~8.1%,表明该方法处理的样品在72 h内具有良好的稳定性。
2.4 方法的初步应用
应用该方法系统性地开展了鲫鳃靶器官代谢组学研究[23]。结果显示,依据本方法可定性的代谢物数量平均达8000余种。对其中的高质量物质进行统计,二级定性物质数量均超过600余种。捕获代谢物包括氨基酸类、碳水化合物类、有机酸及其衍生物类、核苷酸及其类似物、甘油酯类等二十余种。与同类研究相比,所获得的代谢物数目更多,覆盖范围广泛且无偏向性。在后续的差异代谢物筛选分析过程中,共筛选出显著差异代谢物200余种,而前期采用未经优化的方法仅筛选出100余种。本方法发现的差异代谢物数量提高了1 倍以上,从而显著提高了发现代谢性生物标记物的概率,为开展鱼类鳃靶器官代谢组学研究提供了可靠的方法学依据。
3 结论
本研究针对鱼类鳃靶器官代谢组学分析过程中存在的科学问题,对影响样品前处理以及仪器分析过程中的关键因素开展了系统研究,建立了一种基于UPLC-QTOF MS 检测技术的鱼类鳃组织代谢组学分析方法。结果表明,该方法具有精密度高、稳定性好、特异性强等特点,符合高通量代谢组学研究的基本要求。研究结果为各种鱼类鳃靶器官的高通量代谢组学研究提供了技术支持,可为解析鳃器官在细胞层面发生的代谢调控规律提供方法学基础,具有重要的现实科学意义。
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