11β-羟基类固醇脱氢酶Ⅰ型在不同年龄段大鼠眼内的表达与分布

陈薪安 林永 叶菊秀

11β-羟基类固醇脱氢酶Ⅰ型（11β-hydroxysteroid dehydrogenase type 1,11β-HSD1）是一种低亲和力NADP+依赖的脱氢酶/11-氧化还原酶，成年人或动物体内分布广泛，以肝脏、脂肪组织和中枢神经系统中含量最高。11β-HSD1在人体细胞内负责氢化可的松与可的松之间（在动物中则负责皮质酮与皮质醇之间的转化）的转化，使无活性的可的松转变为有活性的氢化可的松，从而调节局部器官糖皮质激素（Glucocorticoid,GC）水平，进而改变局部组织或器官的糖、蛋白质和脂肪等合成和代谢水平。在妊娠后期，11β-HSD1表达增加，以提高GC浓度促进胎儿组织发育成熟，但过量的GC则会导致胎儿宫内发育迟缓，而且增加胎儿成年后患高血压、心脑血管疾病和糖尿病等疾病的几率。作为GC在局部组织的受体前调节器，11β-HSD1成为研究肥胖、代谢综合征、糖尿病等GC相关疾病的发生机制和治疗方法的重要靶点。

目前，研究多集中在11β-HSD1在GC相关疾病方面的作用；但是对于11β-HSD1 在不同年龄段大鼠眼部的分布、表达变化和眼发育的相关性研究较少。本研究通过检测11β-HSD1在不同日龄SD大鼠眼球和视网膜组织中表达情况，观察其在眼组织分布及随SD大鼠发育成熟的变化情况，分析11β-HSD1在眼部正常发育过程中的作用，为今后研究11β-HSD1与眼部疾病相关性奠定基础。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组

Sprague-Dawley（SD）大鼠由温州医科大学实验动物中心提供，雄性，SPF（Specific Pathogen Free）级。实验方案经温州医科大学动物伦理委员批准，符合实验动物伦理规范。分别选取1～2日龄新生SD大鼠（Postnatal day 1，PND1）、5～6日龄SD大鼠（PND5）、10～11日龄SD大鼠（PND10）、14～15日龄刚开眼SD大鼠（PND15）、20～21日龄SD大鼠（PND20）和8～9周龄健康成年SD大鼠（Mature adult rat，M），共6个年龄组，每组6只。取SD大鼠眼球和视网膜作为实验材料，分别检测PND1、PND15和M组11β-HSD1 蛋白与PND1、PND5、PND10、PND15、PND20和M组11β-HSD1 mRNA。

1.2 仪器和试剂

11β-HSD1多克隆抗体由葛仁山教授（原美国洛克菲洛大学）惠赠；Trizol、RNAse-free Dnase I购自美国Invitrogen公司；M-MLV Reverse Transcriptase Kit购自美国Promega公司；SYBR Green PCR Master Mix 购自美国ABI公司；广谱即用型SABC试剂盒和DAB显色试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司；BCA蛋白定量试剂盒、ECL化学发光检测试剂盒均购自美国Pierce公司；PVDF膜购自美国Millipore公司；医用X射线胶片购自美国Kodak公司；SDS-PAGE试剂购自美国Amresco公司；其他常用化学试剂均为国产分析纯。

1.3 免疫组织化学（Immunohistochemistry，IHC）检测

SD大鼠经过安乐死后，解剖获得眼球，并迅速置于预冷的含4%多聚甲醛的0.1 mol磷酸缓冲液（Phosphate buffer solution,PBS）（pH=7.2）中固定，按常规石蜡包埋后连续切片，切片厚度为4 μm，使用涂有多聚赖氨酸包被载波片捞片，于60 ℃烤片2 h，经脱蜡、水平衡后，按SABC试剂盒说明书进行操作：切片经3%HO灭活内源性酶、复合消化液中修复抗原后，用山羊血清封闭；然后一抗结合（兔抗11β-HSD1多克隆抗体）；再与生物素化标记二抗结合；滴加SABC试剂后；DAB显色，显微镜观察，蒸馏水充分冲洗；苏木素轻度复染细胞核；梯度乙醇脱水，中性树胶封片。用已知阳性片（睾丸组织）作阳性对照，用PBS取代一抗作阴性对照。DAB显色后细胞出现棕黄色颗粒表示阳性。

1.4 RT-PCR检测11β-HSD1 mRNA表达

1.4.1 引物的设计与合成 从Genebank（http://www.ncbi.nlm.nih.gov）获取11β-HSD1和RPS16序列，采用Primer Premier 5.0引物设计软件，获得最佳PCR引物（由上海鼎安生物技术公司合成），见表1。

1.4.2 RNA提取和逆转录 按Trizol法操作步骤提取角膜和视网膜匀浆组织总RNA，Agarose凝胶电泳和紫外分光光度计定量。取1 μg角膜或视网膜总RNA经25 U RNase-free DNase I处理以去除基因组DNA污染，RT反应体系25 μl按RT-PCR试剂盒说明书进行逆转录。

1.4.3 实时定量PCR分析 在96 Real-time孔板内依次加入：2×SYBR Green PCR Master Mix 10 μl，10 μmol/L的上下游引物各1 l，cDNA模板1 l，Rnase-free water 7 l。反应通过ABI公司的Gene Amp 7500 PCR仪进行，反应条件：95 ℃ 10 min启动HotStarTag酶活性，95℃ 30 s，62℃ 30 s，72℃ 15 s，共40个循环。反应结束后，以相应融解曲线来判断扩增产物的特异性。所有样品均重复3孔并计算CT平均值，并获得2值，以用来定量分析不同基因mRNA水平的表达差异。2表示不同分组间表达量的倍数。以RPS16作为内参。

1.5 Western blot分析

SD大鼠安乐死后立即摘取眼球，置冰上，解剖显微镜下剥离视网膜，置于100 μl组织细胞裂解液（20 mmol/L Tris-HCl,pH 7.5，150 mmol/L NaCl;10 ml/L Triton X-100，1 mmol/L EDTA，1 mmol/L PMSF，250 mmol/L NaPO，1 mmol/L NaF;1 mmol/L NaVO）中，玻璃匀浆器匀浆，1 000 r/min离心5 min取上清，用BCA蛋白定量试剂盒检测蛋白浓度。参照文献[13]的步骤：蛋白经SDS-PAGE电泳分离，转移到PVDF膜上。该膜经脱脂奶粉封闭后，加入兔抗11β-HSD1抗体，4℃孵化过夜，洗膜后用辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG室温育1 h，再洗后用ECL显色，X射线片暗盒曝光。抗GAPDH抗体作为蛋白质上样量对照。显色带行计算机扫描，采用Floorchem V 2.0软件进行分析，以目的蛋白带的吸光密度面积与GAPDH蛋白条带吸光密度面积的比值作为目的蛋白的相对含量。

1.6 统计学方法

实验研究。采用GraphPad Prism 6.0.1或SPSS26.0数据分析软件进行数据统计分析。符合正态分布的计量数据，以表示，采用单因素方差分析或者独立样本的

t

检验进行组间比较。以

P

＜0.05为差异有统计学意义。

表1.和 PCR引物序列
Table 1.PCR primers sequnces of and

2 结果

2.1 11β-HSD1在SD大鼠眼组织的分布

IHC结果显示，PND1 组的视网膜整个细胞层均明显阳性染色（见图1A—C）；PND15 组和M组视网膜神经节细胞层和色素上皮层细胞呈阳性染色，巩膜和脉络膜中的阳性染色均不明显（见图2）。PND1组角膜上皮呈阳性染色（见图1D—E），角膜中部分细胞呈阳性染色；PND1组角膜内皮细胞阳性染色明显（见图1D），PND15 组和M组角膜内皮细胞无阳性染色（见图2）。PND1 组的整个睫状体细胞明显阳性（见图1E），PND15 组和M组睫状体色素上皮细胞呈阳性（见图2）。PND1 组晶状体囊膜上皮细胞和前囊纤维细胞明显阳性（见图1F），而PND15组阳性染色较弱，M组由于晶状体较硬，切片效果不佳而未检测。

2.2 RT-PCR检测结果

从PND1 组、PND5 组到PND10 组，角膜中的

11β-HSD1

mRNA相对表达量高且呈升高的趋势，PND10 组的

11β-HSD1

mRNA相对表达量最高，PND15 组、PND20 组和M组角膜中的

11β-HSD1

mRNA相对表达量出现下降，差异有统计学意义（

F

=8.40，

P

＜0.001），见图3。视网膜中

11β-HSD1

mRNA相对表达量与角膜中的略有差异，PND1组、PND5组和PND10组

11β-HSD1

mRNA相对表达量处于相对较高水平，其中PND5组视网膜

11β-HSD1

mRNA相对表达量最高，PND15 组、PND20 组和M组视网膜中的

11β-HSD1

mRNA相对表达量均出现明显下降，差异有统计学意义（

F

=83.50，

P

＜0.001），见图4。

2.3 Western bolt检测结果

大鼠视网膜内11β-HSD1 蛋白在不同年龄组的表达情况与其mRNA结果基本一致，PND1组的视网膜中的11β-HSD1蛋白高表达，PND15组和M组视网膜内的11β-HSD1 蛋白表达则出现显著下调，与PND1 组比差异均有统计学意义（PND15：

t

=4.76，

P

=0.009；M：

t

=4.24，

P

=0.013）。

3 讨论

11β-HSD1 具有组织特异性，参与调节组织器官的细胞内GC水平，从而影响局部组织或器官的糖、蛋白质和脂肪等合成和代谢水平以及调控体内炎症反应。本研究对11β-HSD1 在SD大鼠的眼组织的分布进行分析发现，角膜、虹膜、视网膜、巩膜、晶状体上皮、睫状体等组织均有11β-HSD1 表达，尤其是角膜上皮（包括新生鼠角膜内皮）、虹膜、视网膜神经节（包括新生鼠神经母细胞层）中11β-HSD1 阳性细胞更为丰富。这表明11β-HSD1 广泛存在于SD大鼠的眼组织内。进一步对比分析11β-HSD1 在SD大鼠发育过程中的时空变化发现，新生SD大鼠视网膜只有2 层，外核层和内核层都没有分化出来，几乎整个细胞层均有11β-HSD1表达；而开眼后和成年大鼠视网膜分化成10 层，11β-HSD1 主要表达于视网膜神经节细胞层和色素上皮层细胞；另外，11β-HSD1 的表达随角膜的发育也出现差异，新生SD大鼠角膜上皮只有一层，均高度表达11β-HSD1，而开眼后和成年的大鼠角膜上皮已经分化成4～5 层，仅部分细胞表达11β-HSD1；新生鼠角膜内皮细胞也明显地表达11β-HSD1，开眼后和成年大鼠角膜内皮不表达；新生鼠的睫状体的突起和分枝还未分化形成，11β-HSD1 表达明显，开眼后和成年大鼠睫状体突起形成并分枝，睫状体色素上皮细胞表达11β-HSD1。新生鼠的晶状体囊膜上皮细胞和前囊纤维细胞也高表达11β-HSD1，而开眼后大鼠表达不明显。随后实验结果也证实了开眼前SD大鼠眼组织中的

11β-HSD1

mRNA和蛋白水平高于开眼后和成年SD大鼠。这提示了11β-HSD1可能参与SD大鼠眼部的分化成熟过程。我们推测开眼前SD大鼠眼组织高表达11β-HSD1，可促使局部组织的GC处在相对较高水平，提高了新生SD大鼠眼组织细胞内物质合成和代谢水平，为大鼠眼组织能够在接下来的2周内快速分化提供了保障，当分化完成以后，11β-HSD1表达量则开始降低并维持在一定水平。

图1.11β-羟基类固醇脱氢酶Ⅰ型（11β-HSD1）在新生SD大鼠（PND1）眼组织中的表达分布A：视网膜层、角膜及睫状体（×100）；B—C：视网膜（×400）；D：角膜（×400）；E：角膜及睫状体（×400）；F：晶状体（×400）Figure 1. Distribution of 11β-HSD1 in eyes of neonatal SD rats (PND1) by IHC.A:Retina,cornea and ciliary body (×100);B-C:Retina (×400);D:Cornea (×400);E:Cornea and ciliary body (×400);F:Lens (×400).11β-HSD1,11β-hydroxysteroid dehydrogenase type 1;SD,Sprague-Dawley;IHC,immunohistochemistry

图2.11β-羟基类固醇脱氢酶Ⅰ型（11β-HSD1）在不同年龄段大鼠眼组织内的表达对比（×400）PND1组眼组织中11β-HSD1阳性细胞数多于PND15组和M组Figure 2. Comparison of 11β-HSD1 in the different age’s rat eyes by IHC (×400)The number of 11β-HSD1 positive cells in eyes of PND group SD rats was higher than that of PND 15 group and M group.

图3.SD大鼠不同时期角膜内11β-羟基类固醇脱氢酶Ⅰ型（11β-HSD1）mRNA表达分析Figure 3. Comparative analysis of 11β-HSD1 mRNA in the cornea of different age's SD rats.

图4.SD大鼠不同时期视网膜内11β-羟基类固醇脱氢酶Ⅰ型（11β-HSD1）mRNA表达分析Figure 4. Comparative analysis of 11β-HSD1 mRNA in the retina of different age's SD rats.

图5.SD大鼠不同时期视网膜内11β-羟基类固醇脱氢酶Ⅰ型（11β-HSD1）蛋白表达分析（每组6只）A：11β-HSD1蛋白印迹杂交图谱；B：11β-HSD1蛋白的相对表达量分析。a，与PND1组比较，P＜0.05Figure 5. Comparative analysis of 11β-HSD1 protein in the retina of different age’s SD rats (6 in every group).A:Western blot hybridization map of 11β-HSD1 protein;B:Relative expression of 11β-HSD1 protein.The expression of 11β-HSD1 protein in eyes of the neonatal SD rats was significantly higher than that of eyelid opening and mature adult SD rats.

已有研究表明，在一定条件下，组织内11β-HSD1表达增加会导致局部内源性激素水平长期升高，是导致GC相关疾病发生的重要原因。在激素诱发股骨头坏死的研究中，治疗性外源性激素可提高松质骨区微血管内皮细胞内11β-HSD1表达量，增加局部GC的含量，抑制骨髓间质干细胞成骨细胞能力，揭示了11β-HSD1与股骨头坏死发生之间可能存在相关性。在认知和记忆的研究中发现，脑区海马内11β-HSD1活性增强导致的GC浓度长期升高是导致海马萎缩和记忆缺陷的重要原因，通过11β-HSD1抑制剂或11β-HSD1基因敲除等方法，可以改善认知和修复记忆。此外，11β-HSD1在肥胖和糖尿病等代谢性疾病中的作用也得到了证实。由于11β-HSD1在很多疾病的发生过程中起到关键调控作用，人们对11β-HSD1组织选择性抑制剂在阿尔兹海默症、糖尿病、肥胖、代谢综合征、干眼病、青光眼等疾病的治疗作用进行了研究，取得了一定进展。本研究发现开眼后和成年SD大鼠眼组织内11β-HSD1 mRNA及蛋白表达水平相对较低，这可能对于维持眼部低水平GC含量，保证局部器官组织生理平衡和健康具有重要意义，这也从另一个角度印证了上述11β-HSD1相关疾病的研究结果。

综上所述，本研究对比分析了11β-HSD1在新生、刚开眼和成年阶段的SD大鼠眼组织内的分布和表达的时空变化，发现11β-HSD1在各年龄段眼组织内广泛存在但具有表达差异，其在新生期眼组织内表达水平高于刚开眼和成年后，初步揭示了11β-HSD1可能在新生SD大鼠眼分化发育中起重要作用，并推测11β-HSD1在发育成熟的眼组织内低水平表达是维持眼健康的重要原因。本研究仅在11β-HSD1水平上探索了其在出生后SD大鼠眼组织的分化发育过程中的变化，但未进行11β-HSD1活性和GC水平的研究，其在眼发育过程中具体机制还需进一步的研究验证。本研究为眼发育奠定了基础，并为下一步研究眼相关疾病的发病机制和寻找有效的治疗方案提供了数据支持。

利益冲突申明

本研究无任何利益冲突

作者贡献声明

陈薪安：收集数据；参与选题、设计及资料的分析和解释；撰写论文；根据编辑部的修改意见进行修改。林永：参与选题、设计和修改论文的结果、结论。叶菊秀：参与选题、设计、资料的分析和解释；修改论文中关键性结果、结论；根据编辑部的修改意见进行核修