2-卤代酸脱卤酶的表达优化

2022-08-16王亚月董超群靳志远张萌萌裴冬丽

商丘师范学院学报 2022年9期

王亚月，董超群，靳志远，张萌萌，裴冬丽

(商丘师范学院生物与食品学院，河南商丘 476000)

含卤有机物在医学和化学领域发挥着举足轻重的作用，被广泛用于除草剂、杀虫剂、抗生素、药品、塑料制品及有机合成中间体，然而由于这类化合物的不当使用，导致有机卤化物在环境中积累.由于很多卤代物具有“致癌、致畸、致突变”效应[1]，其在用于生产活动的同时给环境和人类带来严重的危害.因此，对有机卤代物脱卤的研究具有重要意义.

微生物作为自然界中主要分解者，将复杂的有机物转化为简单的化合物，从而保持生命元素的循环往复.生长在被有机卤代物污染的环境中的微生物具有转化这些化合物的能力，即其细胞内存在催化脱卤作用的酶，这类酶被称为脱卤酶.DL-2-卤代酸脱卤酶(2-haloacid dehalogenase)j 催化裂解卤代酸中碳-卤键断裂的一类酶，使之脱去卤素原子，并产生所对应的2-羟基羧酸化合物[2].2-卤代酸脱卤酶具有反应底物广谱性和高效的立体选择性，并且在催化水解反应中无需添加还原剂，因而在环境修复与化工合成领域具有巨大应用价值.如可制备手性羟基酸与卤代酸，用作农药、医药及化工合成的中间体[3-6].

目前已报道的DL-2-卤代酸脱卤酶相对较少，包括分离自Pseudomonassp.113的DL-DEX 113，PseudomonasputidaPP3的DehI与Methylobacteriumsp.CPA1的DL-DEX Mb[7-9].天然酶的表达量通常很低，从而限制了改酶的应用及深入研究.本研究以分离自P.putidaPP3 菌株的DL-2-卤代酸脱卤酶DehI为研究对象，通过将构建成功的DehI-pET28a重组质粒转入EscherichiacoliBL21(DE3)，进行原核表达，为获得较多可溶性表达蛋白，并对其表达条件进行优化.以为进一步研究改酶的对映体选择性机制和改造奠定基础.

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和质粒

DehI-pET28a重组质粒，E.coliBL21(DE3)感受态细胞.

1.1.2 主要试剂

氯化钙(Sigma-aldrich，Germany )，异丙基硫代半乳糖苷IPTG(Takara，北京)，卡那霉素(上海生工)，L-2-氯丙酸(上海梯希爱)，丙烯酰胺(上海生工)，甲叉-双丙烯酰胺(上海生工).

1.1.3 培养基

LB培养基：胰蛋白胨10 g/L、酵母浸粉5 g/L、NaCl 10 g/L(用1 mol/L的NaOH调至pH=7.5，121 ℃，灭菌20 min)；LB固体培养基则是在上述基础上加入18 g/L琼脂.

1.2 实验方法

1.2.1 构建DehI原核表达载体

将前期构建成功的DehI-pET28a重组质粒转化至E.coli BL21(DE3)感受态细胞.

1.2.2 DehI表达条件优化

表1 DehI表达条件优化

续表1

如表1，分别从IPTG浓度，IPTG加入时间，IPTG诱导时间与诱导温度4个因素方面进行优化，设置因素水平，IPTG浓度分别为0.1 mmol/L，0.2 mmol/L，0.5 mmol/L，0.7 mmol/L与1 mmol/L；IPTG加入时间分别是OD600 nm为0.3，0.5，0.6，0.8，0.9，1时加入；IPTG诱导时间分别为3 h，5 h，7 h，9 h与12 h；诱导温度分别为15 ℃，20 ℃，25 ℃，30 ℃与37 ℃.基于随机区组理论基础，使用Design-expert软件对DehI诱导表达条件进行组合，共获得30个诱导条件组合(表1).

取活化的重组菌株菌液0.5 mL转移至50 mL含50 μg/mL 卡那霉素的LB培养基，37 ℃，220 r/min培养至表1中每个诱导组对应OD600nm，调至转速为180 r/min，并置于表1中相应条件下进行诱导表达.诱导结束后，于8000 r/min，4 ℃，离心30 min收集菌体，-80 ℃冻存备用.

1.2.3 粗酶液制备

取冻存的菌体，重悬于5 mL预冷的裂解缓冲液(50 mmol/L KH2PO4-K2HPO4，pH=8.0)中，冰浴条件下超声破碎(200 W，工作2 s，间隙2 s,120循环).12000 r/min，4 ℃，离心30 min，收集上清，即为粗酶液.

1.2.4 表达产物SDS-PAGE分析

通过 SDS-PAGE 方法鉴定不同组合条件下蛋白表达情况[10].取粗酶液45 μL，加入5 μL上样缓冲液，混匀，煮沸10 min，运用12% SDS-PAGE进行电泳，结束后使用考马斯亮蓝G-250染液染色，经脱色后，观察蛋白条带颜色深浅判断DehI表达水平.

1.2.5 酶活性分析

反应体系1 mL，包括：10 mmol/L L-2-氯丙酸，100 mmol/L，pH10甘氨酸-NaOH，200μL待测酶液，在30 ℃水浴中反应30 min，加入1%(v/v)的浓磷酸(85% w/w)终止反应.12000 r/min，离心10 min去除沉淀.通过HPLC检测氯丙酸的减少确定酶活性[11].酶活单位(U)定义为:每分钟催化转化1 μmol 氯丙酸所需要的酶量.

注:M,纯化的DehI蛋白.图1 诱导组合1-17条件下重组蛋白表达产物 SDS-PAGE图

注:M,纯化的DehI蛋白.图2 诱导组合18-30条件下重组蛋白表达产物SDS-PAGE图

2 结果与分析

2.1 DehI表达产物SDS-PAGE分析

通过SDS-PAGE检测不同诱导条件组合下蛋白表达量.如图1和图2所示，不同诱导组合条件下均获得可溶性表达，蛋白表达量不尽相同.诱导组合3，7，8，9，12，15，16，20，21，27与28条件下获得的蛋白表达量较高.其中，诱导组合3，8与16条件下蛋白条带颜色最深，蛋白量相对较多，即诱导条件3：细胞OD600nm值为0.8，IPTG浓度为0.2 mM，诱导温度为30 ℃，诱导时间为9 h；诱导条件8：细胞OD600nm值为0.6，IPTG浓度为0.1 mM，诱导温度为25 ℃，诱导时间为7 h；诱导条件16：细胞OD600nm值为0.5，IPTG浓度为0.7 mM，诱导温度为30 ℃，诱导时间为5 h；这3种组合下的诱导条件可作为DehI重组蛋白的表达条件.

2.2 粗酶活性分析

考虑到SDS-PAGE操作过程中的误差，进一步分析了不同组合诱导条件下获得的粗酶液活性.如图3所示，通过对不同组合酶活性分析，发现第3组诱导条件下所获得的DehI催化活性最高为1.36 U/mL粗酶液，与常用诱导表达条件(OD600 nm为0.5，0.5 mM IPTG，37 ℃诱导4 h)相比提高7.6倍；其次是第16组与第20组，催化活性分别是0.90 U/mL与0.75 U/mL粗酶液，与SDS-PAGE结果一致.综上可知：第3组诱导条件即菌液OD600 nm为0.8，IPTG终浓度为0.2 mM，温度为30 ℃，时间为9 h时，所获得的活性蛋白量最高，因此可作为后续研究DehI的诱导表达条件.