间苯三酚分光光度法测定燕窝中的海藻酸钠

2022-08-16李国栋张亚云

广州化工 2022年14期

李丹，李国栋，张亚云

(1 至睿生物(江苏)有限公司，江苏太仓 215400；2 苏州珩悦环保工程有限公司，江苏太仓 215400;3 江苏国测检测技术有限公司，江苏昆山 215300)

海藻酸钠是一种常用的食品添加剂[1-2]，是从褐藻类的海带或马尾藻中提取碘和甘露醇之后的副产物[3-4]，是一种天然多糖[5-6]。由于其水溶液具有较高的黏度，因此在食品行业常被用作增稠剂[7]、稳定剂[8]、乳化剂等。在燕窝中适量添加海藻酸钠，可以使燕窝口感柔滑[9]、细腻，在搅拌时有粘性[10-11]，并有迟滞感。国标GB 1886.243-2016 《食品安全国家标准食品添加剂海藻酸钠(又名褐藻酸钠)》中有对海藻酸钠的鉴别试验，但仅能对其定性、不能定量，且所需的试样溶液浓度较高，而作为添加剂的海藻酸钠在燕窝中含量较低，检测效果不明显。目前还没有关于海藻酸钠作为食品添加剂定量测定其含量的国家标准[12]，而余德寿在《海藻酸钠测定分光光度法》一文中提到，海藻酸钠由β-D甘露糖醛酸和a-L-古洛糖醛酸按(1→4)键连接而成，分子中的醛基物质能与间苯三酚反应生成黄色络合物，其色泽的深浅与海藻酸钠含量呈正相关关系[13]。因此，本文在其研究的基础上，研究了间苯三酚分光光度法[14]测定燕窝中海藻酸钠含量的方法。实验中探讨了与海藻酸钠反应的最佳间苯三酚的加入量，盐酸加入量的影响[15-16]，酸性条件下海藻酸钠与间苯三酚的水浴反应时间的确定[17]，显色后黄色络合物的稳定时间[18]，以及黄色络合物的最大吸收波长。

1 实验部分

1.1 仪器、试剂与材料

1.1.1 仪器

UV-1100紫外可见分光光度计，上海美谱达仪器有限公司；FA 2004电子天平，邦西仪器科技(上海)有限公司。

1.1.2 试剂

间苯三酚(25 g，麦克林)溶液：称取1.000 g间苯三酚，溶于无水乙醇，定容至100 mL；海藻酸钠(25 g，麦克林)标准储备液：称取0.200 g海藻酸钠，用热水溶解后，转移至100 mL容量瓶并定容(使用液：稀释成0.2 g/L)；盐酸(500 mL)，江苏强盛功能化学股份有限公司；碳酸钠(500 g)，南京化学试剂股份有限公司。

以上试剂均为分析纯或优级纯，所用水为三级去离子水。

1.1.3 材料

市售的某品牌燕窝。

1.2 实验条件

1.2.1 测定原理

以间苯三酚溶液为显色剂，海藻酸钠在酸性条件下，分子中的醛基物质与间苯三酚在沸水浴中反应生成黄色络合物，在440 nm吸收波长下测定吸光度。通过标准曲线计算出海藻酸钠的含量。

1.2.2 标准曲线的绘制

取10 支25 mL比色管，依次加入0.00 mL，0.50 mL，0.75 mL，1.00 mL，1.25 mL，1.5 mL，1.75 mL，2.00 mL，2.25 mL，2.50 mL[13]海藻酸钠标准使用液，分别加入10.00 mL盐酸，混匀后各加入0.70 mL间苯三酚溶液，混匀，置于沸水浴中显色反应65 min，取出后用流水降至室温，定容至刻度，以空白管为参比，在440 nm处测定其吸光度。以海藻酸钠含量为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线。

1.2.3 样品的测定

移取2.00 mL燕窝试样于100 mL容量瓶，加入1.000 g固体碳酸钠[19-20]，在85 ℃水浴条件下加热3 h，取出冷却后过滤。移取1.00 mL滤液于25 mL比色管中，使之按照1.2.2中步骤操作，测定吸光度。通过吸光度代入标准曲线即可得出海藻酸钠含量。

2 结果与讨论

2.1 实验条件确定

2.1.1 吸收波长

取1.00 mL海藻酸钠标准使用液，加10.00 mL盐酸，混匀后加0.70 mL间苯三酚溶液，混匀，置于沸水浴中显色反应 65 min，取出用流水冷却后定容，在不同波长下测定其吸光度。由图1可以看出，海藻酸钠的最大吸收波长为440 nm。

图1 吸收波长对吸光度的影响Fig.1 Effect of absorption wavelength on absorbance

2.1.2 显色剂用量

分别吸取不同体积的显色剂，按上述条件进行操作并对海藻酸钠含量进行测定，研究显色剂用量对测定的海藻酸钠含量的影响。图2的结果表明，随着显色剂用量的增加，海藻酸钠测定值增大。当显色剂用量增加到0.70 mL以上时，海藻酸钠测定值反而降低，这是因为过量的显色剂与反应产物继续发生作用，使反应过程逆向进行。因此，选用0.70 mL作为显色剂用量的最佳条件。

图2 显色剂用量对吸光度的影响Fig.2 Effect of developer dosage on absorbance

2.1.3 酸性条件(盐酸加入量)

分别加入不同的盐酸量按上述条件进行操作并对海藻酸钠含量进行测定，研究不同酸性条件对测定得出的海藻酸钠含量的影响。由图3可以看出，随着盐酸加入量的增加，海藻酸钠测定值不断增大。当盐酸量增大到10.00 mL以上时，盐酸已过量，测定出的海藻酸钠含量出现降低的趋势，这是因为反应溶液中逐渐出现黄棕色沉淀，即选取10.00 mL盐酸量作为显色反应的最佳酸性条件。

图3 盐酸加入量对吸光度的影响Fig.3 Effect of hydrochloric acid dosage on absorbance

2.1.4 水浴显色时间

图4 水浴时间对吸光度的影响Fig.4 Effect of water bath time on absorbance

分别选取不同的水浴显色时间，用秒表计时，水浴显色结束后立即用流水冷却，按上述条件进行操作并对海藻酸钠含量进行测定，分析水浴显色时间对海藻酸钠的影响。图4结果表明，水浴显色时间对海藻酸钠含量的影响很大。随着加热时间的延长，测得的海藻酸钠含量不断增大，这是因为随着反应时间的延长，显色反应更加彻底。但当加热到65 min之后，测得的海藻酸钠含量逐渐降低，这可能是因为加热时间过长，会发生一些副反应导致海藻酸钠含量降低。由图4可见，加热 65 min时海藻酸钠测定值最高，因此最佳条件下的水浴显色时间为65 min。

2.1.5 显色后的放置时间

按照上述条件，取出用流水冷却后定容，通过不同的放置时间测定其吸光度，研究放置时间对海藻酸钠含量的影响。由图5的结果表明，放置时间在15 min以内时，测定的海藻酸钠含量相对稳定，随着放置时间的延长，海藻酸钠的含量不断增加，表明放置15 min之后，海藻酸钠的含量不再稳定。因此显色反应结束后应立即比色，且比色时间以不超过15 min为宜。

图5 显色后放置时间对吸光度的影响Fig.5 Effect of storage time on absorbance after color development

2.2 工作曲线与检出限

方法线性方程为y=3.4609x+0.0148，r2=0.9996；线性范围为0～0.5 mg。根据6次最低浓度点(0.1 mg)的测定值的标准差(S)，以3S计算求得方法的检出限为0.03 mg/mL。

2.3 精密度实验

分别配制海藻酸钠标准溶液的含量为0.15 mg，0.30 mg，0.45 mg，重复测定6次。精密度测定结果如表1所示，海藻酸钠的相对标准偏差在1.58%～3.78%之间，可满足海藻酸钠测定试验的要求。

表1 海藻酸钠精密度的测定结果Table 1 Determination results of precision of sodium alginate

2.4 样品的加标回收率试验

分别移取燕窝试样(燕窝1含有海藻酸钠、燕窝2不含海藻酸钠)2.00 mL于100 mL容量瓶，每个样品6份，加入海藻酸钠标准使用液0.5 mL、1.25 mL、2.25 mL(每种浓度2个)，其余步骤同1.2.3；由6个测定结果计算得出燕窝中海藻酸钠的含量，同时计算回收率，并得出6个回收率的平均值和RSD。结果显示：燕窝1的海藻酸钠加标回收率范围在90.0%～104.0%，均值为96.2%，RSD为5.5%；燕窝2的海藻酸钠加标回收率范围在85.0%～97.8%，均值为92.7%，RSD为4.8%。