miR-30b 在高磷诱导的血管平滑肌细胞凋亡中的作用

刘 兰张东雪张胜雷白亚玲

(河北医科大学第四医院 肾内科,石家庄 050011)

血管钙化能够增加心脏病、动脉粥样硬化斑块破裂、脑卒中的风险,是增加心血管疾病发病率和死亡率的重要危险因素[1-2]。 血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells,VSMCs)凋亡是血管钙化的重要机制之一[3]。 此外,研究发现[4],miRNAs在细胞成骨转化、细胞转移及细胞凋亡中起重要作用。 miR-30b 是miR-30 家族的一员[5],在人体组织中广泛表达,且已有报道显示,miR-30b 能够靶向调控人主动脉瓣瓣膜间质细胞的钙化[6]。 但miR-30b在血管平滑肌细胞凋亡中的作用机制尚不明确。因此,本研究对大鼠VSMCs 进行体外培养,在高磷环境中探讨miR-30b 参与调节大鼠血管平滑肌细胞凋亡的可能机制。

1 材料和方法

1.1 实验动物

取SPF 级雄性健康SD 大鼠6 只,4 周龄,体重约80~100 g,由河北医科大学实验动物中心提供[SCXK(冀)2020-002],合格证编号:1305090。 将实验动物饲养于河北医科大学第四医院实验动物中心[SYXK(冀)2018-001],环境温度18℃~24℃,湿度40%~60%,12 h/12 h 明/暗循环环境,饲料、饮水均经过高压灭菌处理。 本研究已通过河北医科大学第四医院伦理委员会审核(2021KY044),所有动物实验操作均在3R 原则的指导下给与实验动物人道主义关怀。

1.2 主要试剂与仪器

DMEM 培养液(批号:31600-034)(美国Gibco公司); 胎牛血清(批号: A0500-3210) (美国Cegrogen 公司);β-甘油磷酸(批号:SLCD0875)(美国Sigma 公司);RNA 反转录试剂盒及实时荧光定量PCR 试剂盒(批号:R11068.5)(锐博生物公司);miR-30b 的抑制物(批号:R11035.4)(锐博生物公司); GAPDH 抗 体( 批 号: AP0063) ( 美 国Proteintech,公司);BAX 抗体(批号:50599-2-Ig)(美国Proteintech 公司);Bcl-2 抗体(批号:AF6139)(美国Affinity 公司);山羊抗兔二抗(批号:5220-0336)(美国Seracare 公司)。

实时荧光定量PCR 仪(批号:QuantStudio DX)(美国life 公司);倒置相差显微镜(批号:Axio Observer D1)(日本OLYMPUS 公司);细胞培养箱(批号:150i)(美国Sheldon 公司);酶标仪(批号:CytationⅢ (美国Biotek 公司);蛋白电泳仪(批号:10025025 Rev A 12-0625 0312)(美国BIO-RAD 公司); 凝胶成像系统(批号: FR0146) (美国Proteinsimple 公司)。

1.3 实验方法

1.3.1 实验模型的制备与分组

对实验大鼠进行称重,根据体重腹腔注射200 mg/kg 的戊巴比妥钠进行麻醉,75%乙醇溶液浸泡消毒10 min 后,经腹部中线纵行切口,依次分离进入胸腔,取大鼠胸主动脉,分离中膜层,剪成1 mm×1 mm×1 mm 的小块,均匀铺于瓶底,组织贴壁法对VSMCs 行原代培养。 贴壁细胞占底壁的80%~90%时进行传代,使用PBS 液冲洗2 次,胰酶消化1 min,加入等量完全培养基,吹打混匀,收集细胞并离心后,按1 ∶2 进行传代培养。 传代至第3~4 代将细胞分为两组:正常组和高磷组(给予10 mmol/L β-甘油磷酸盐),干预7 d 后检测miR-30b、BAX、Bcl-2等指标的变化。 为进一步验证miR-30b 对VSMCs的作用,给予转染miR-30b 的抑制物inhibitor-30b,将细胞分为3 组:(1)正常组:细胞未转染;(2)inhibitor-NC 组:转染20 μmol/L 抑制物的对照inhibitor-NC 5 μL;(3) inhibitor-30b 组: 转 染20 μmol/L 抑制物inhibitor-30b 2.5 μL。 转染72 h 后检测凋亡情况。 为进一步验证高磷环境中miR-30b的作用,给予转染miR-30b 的类似物mimic-30b,将细胞分为3 组:(1)高磷组:10 mmol/L β-甘油磷酸盐培养,细胞未转染;(2)高磷+mimic-NC 组:10 mmol/L β-甘油磷酸盐培养,转染20 μmol/L 类似物的对照mimic-NC 5 μL;(3)高磷+mimic-30b 组:10 mmol/L β-甘油磷酸盐培养,转染20 μmol/L 类似物mimic-30b 5 μL。 转染72 h 后检测凋亡情况。

1.3.2 细胞SM22α 免疫组化染色

取出细胞用4%的中性福尔马林固定30 min,PBS 洗3 次,0.3% Triton-100,作用20 min,PBS 洗3次,H2O2作用15 min,PBS 洗3 次,加入5%山羊清封闭在37℃孵育30 min,加入SM22α 一抗4℃过夜,次日,PBS 洗3 次,加入二抗A 液,作用30 min,PBS 洗3 次,加入二抗B 液,作用30 min,PBS 洗3次,加入DAB 显色液作用30 s,自来水洗3 次,苏木素复染,脱水封片。

1.3.3 MTT 法检测细胞增殖能力

接种于96 孔板中的血管平滑肌细胞融合达60%~70%给予刺激,每组设3 个复孔。 取MTT(5 mg/mL)各检测孔加入20 μL,培养箱中培养4 h,弃去培养液,取二甲基亚砜各检测孔加入150 μL,于室温振荡10 min。 酶标仪490 nm 波长处测定吸光度(A)值,记录结果。

1.3.4 流式细胞法检测细胞的凋亡

给予刺激后,收集细胞,根据试剂说明书进行Annexin V-PE/7-AAD 双重染色,流式细胞仪检测,右上象限Annexin V 为阳性、7-AAD 为阳性,为晚期凋亡细胞;右下象限Annexin V 为阳性、7-AAD 为阴性,为早期凋亡细胞。 实验重复3 次。

1.3.5 实时荧光定量PCR 检测各组miR-30b 表达

分别提取各组的miR-30b。 实验均重复3 次。锐博生物提供的miR-30b 和U6 的引物,U6 为内参,反应条件为:预变性95℃ 10 min;变性95℃ 10 s、退火60℃ 20 s,40 个循环,重复3 次。

1.3.6 Western blot 检测Bcl-2、BAX 蛋白的表达

提取各组VSMCs 的蛋白质,配制SDS-聚丙烯酰胺凝胶(10%),加样20 μg 蛋白质,进行电泳1.5 h(95 V 恒压)。 后转膜1 h(恒压95 V),洗膜3 次,牛清(5%)封闭1 h。 加入一抗稀释液(BAX 1 ∶2000,Bcl-2 1 ∶1000,GAPDH 1 ∶5000),4℃孵育过夜,次日加二抗稀释液(1 ∶5000),37℃孵育1 h。使用蛋白成像系统照膜,实验重复3 次。

1.4 统计学方法

应用SPSS 22.0 统计学软件进行统计学处理,正态分布的计量资料结果用平均数±标准差(±s)表示,两组间比较采用t检验,多组间比较采用单因素方差分析,P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 高磷对VSMCs 增殖凋亡的影响

2.1.1 VSMCs 的原代培养及细胞鉴定

VSMCs 原代培养第3 天,即有血管平滑肌细胞从组织块周围爬出,长至第7 天,组织块周围的细胞相互融合在一起,平行排列、呈束状,部分重叠在一起,呈“峰-谷”状生长。 单个细胞呈梭形、不规则形,以梭形为主,细胞核为卵圆形。 细胞SM22α 免疫组化染色可见细胞浆内呈棕黄色,胞质内的肌动蛋白被染成棕黄色,呈丝状沿细胞长轴平行分布细胞核为蓝色,SM22α 染色为阳性,表明细胞为血管平滑肌细胞,见图1。

注:A:原代培养第3 天的组织块及爬出的血管平滑肌细胞;B:原代培养第7 天的组织块及爬出的血管平滑肌细胞;C:血管平滑肌细胞SM22α 的免疫组化染色,呈棕黄色为阳性。图1 VSMCs 的原代培养及细胞鉴定Note.A, Tissue block and crawled vascular smooth muscle cells on the 3rd day of primary culture.B, Tissue block and crawled vascular smooth muscle cells on the 7th day of primary culture.C, Immunohistochemical staining of SM22α, a vascular smooth muscle cell, was brown and positive.Figure 1 Primary culture and cell identification of VSMCs

2.1.2 高磷对大鼠VSMCs 凋亡的影响

流式细胞仪结果显示,与正常组比较,高磷组细胞凋亡显著增多(t=-12.841,P<0.001),有统计学差异(P<0.05),见图2。

2.1.3 高磷对大鼠VSMCs 增殖的影响

MTT 结果显示:与正常组比较,高磷组细胞增殖能力于12、24、36、48 h 均显著降低(P<0.05)。高磷组与正常组比较,0、12、24、36、48 h 分别为(t=0.105,P=0.921,t=13.03,P<0.001,t=16.892,P<0.001,t=12.659,P<0.001,t=18.049,P<0.001),有统计学差异(P<0.05),见图3。

2.1.4 高磷对BAX、Bcl-2 表达的影响

Western blot 结果显示,高磷组VSMCs 促凋亡基因BAX 上调(t=-4.727,P=0.009)、抑凋亡基因Bcl-2 的表达明显下降(t=-14.872,P<0.001),有统计学差异(P<0.05),见图4。

2.2 高磷对大鼠VSMCs miR-30b 表达的影响

实时荧光定量PCR 结果显示,与正常组比较,高磷组VSMCs miR-30b 的表达明显下降(1.00±0.00 vs 0.387±0.05,t=19.497,P<0.05),有统计学差异(P<0.05),提示高磷能够抑制miR-30b 的表达,见图5。

注:A:正常组与高磷组的流式结果;B:正常组与高磷组凋亡细胞百分比。 与正常组相比,∗∗∗P<0.001。 图2 两组血管平滑肌细胞的凋亡情况(n=3)Note.A, Flow results of normal group and high phosphorus group.B, Percentage of apoptotic cells in normal group and high phosphorus group.Compared with normal group,∗∗∗P<0.001.Figure 2 Apoptosis of vascular smooth muscle cells in two groups

注:A:各组细胞的MTT 结果;B:各组细胞不同时间段的显微镜下照片。 与正常组相比,∗∗∗P<0.001。图3 两组血管平滑肌细胞的增殖情况(n=3)Note.A, MTT results of cells in each group.B, Microscopic photos of cells in each group at different time periods.Compared with normal group,∗∗∗P<0.001.Figure 3 Proliferation of vascular smooth muscle cells in two groups

2.3 miR-30b 对VSMCs 增殖凋亡的影响

2.3.1 miR-30b 低表达对VSMCs 凋亡的影响

流式结果显示,与正常组比较,inhibitor-30b 组VSMCs 凋亡增多(P<0.001),与inhibitor-NC 组比较,inhibitor-30b 组VSMCs 凋亡增多(P<0.001)有统计学差异(P<0.05),提示miR-30b 低表达能够促进VSMCs 凋亡,见图6。

2.3.2 miR-30b 低表达对VSMCs 增殖的影响

MTT 结果显示:与正常组和inhibitor-NC 组比较,inhibitor-30b 组细胞增殖能力于12、24、36、48 h均显著降低(P<0.05)。 正常组和inhibitor-NC 组比较,无统计学差异(P>0.05)。 见图7。

注:与正常组相比,∗∗P<0.01,∗∗∗P<0.001。图4 两组血管平滑肌细胞相关蛋白表达情况(n=3)Note.Compared with normal group, ∗∗P<0.01,∗∗∗P<0.001.Figure 4 Expression of vascular smooth muscle cells related proteins in two groups

注:与正常组相比,∗∗∗P<0.001。图5 两组血管平滑肌细胞的miR-30b 的表达(n=3)Note.Compared with normal group,∗∗∗P<0.001.Figure 5 Expression of miR-30b in vascular smooth muscle cells of the two groups

注:与正常组相比,∗∗∗P<0.001;与inhibitor-NC 组相比, ###P<0.001。图6 各组血管平滑肌细胞的凋亡情况(n=3)Note.Compared with normal group,∗∗∗P<0.001.Compared with inhibitor-NC group, ###P<0.001.Figure 6 Apoptosis of vascular smooth muscle cells in each groups

2.3.3 miR-30b 低表达对BAX、Bcl-2 表达的影响

Western blot 印迹结果结果显示,inhibitor-30b组VSMCs 促凋亡基因BAX 上调(P< 0.01)、抑凋亡基因Bcl-2 的表达明显下降(P<0.01),有统计学差异(P<0.05),见图8。

2.3.4 miR-30b 高表达对VSMCs 凋亡的影响

流式结果显示,与高磷组比较,高磷-mimic-30b组VSMCs 凋亡减少(P<0.01),与高磷-mimic-NC 组比较,高磷-mimic-30b 组VSMCs 凋亡减少(P<0.01),有统计学差异(P<0.05),提示miR-30b 高表达能够抑制VSMCs 凋亡,见图9。

2.3.5 miR-30b 高表达对BAX、Bcl-2 表达的影响

Western blot 印迹结果显示,与高磷组和高磷-mimic-NC 组比较,高磷-mimic-30b 组VSMCs 促凋亡基因BAX 下调、抑凋亡基因Bcl-2 的表达明显上调,有统计学差异(P<0.05),见图10。

注:与正常组相比, ∗P<0.05;与inhibitor-NC 组相较, #P<0.05。图7 各组血管平滑肌细胞的增殖情况Note.Compared with normal group, ∗P < 0.05.Compared with inhibitor-NC group, #P<0.05.Figure 7 Proliferation of vascular smooth muscle cells in each groups

注:a:正常组;b:inhibitor-NC 组;c:inhibitor-30b 组。 与正常组相比,∗∗P<0.01;与inhibitor-NC 组比较, ##P<0.01。图8 各组血管平滑肌细胞相关蛋白表达情况(n=3)Note.a, Normal group.b, Inhibitor-NC group.c, Inhibitor-30b group.Compared with normal group, ∗∗P<0.01.Compared with inhibitor-NC group, ##P<0.01.Figure 8 Expression of vascular smooth muscle cell related proteins in each groups

注:与高磷组相比,∗∗P<0.01;与高磷-mimic-NC 组相比, ##P<0.01。图9 miR-30b 高表达对血管平滑肌细胞凋亡的影响(n=3)Note.Compared with High phosphorus group group, ∗∗P<0.01.Compared with High phosphorus-mimic-NC group, ∗∗P<0.01.Figure 9 Effect of miR-30b overexpression on apoptosis of vascular smooth muscle cells

注:a:高磷组;b:高磷-mimic-NC 组;c:高磷-mimic-30b 组。 与高磷组相比, ∗P<0.05;与高磷-mimic-NC 组相比, #P<0.05。图10 miR-30b 高表达对相关蛋白表达的影响(n=3)Note.a, High phosphorus group.b, High phosphorus-mimic-NC group group.c, High phosphorus-mimic-30b group.Compared with High phosphorus group, ∗P<0.05.Compared with High phosphorus-mimic-NC group group, ∗P<0.05.Figure 10 Effect of miR-30b overexpression on expression of related proteins

3 讨论

心血管疾病死亡率增高的独立危险因素是血管钙化[7]。 而细胞凋亡是调控血管钙化的重要机制之一[8]。 而参与细胞凋亡的机制有多种,高磷血症是导致血管中膜钙化的重要危险因素之一[9],而VSMCs 是血管中膜的重要组成成分。 因此本研究采用大鼠VSMCs,给予高磷刺激,探究血管平滑肌细胞凋亡和血管钙化的发生机制。 本研究结果显示,高磷可导致血管平滑肌细胞发生凋亡,其机制可能是通过下调miR-30b 表达,促进凋亡蛋白BAX表达,抑制抗凋亡蛋白Bcl-2 的表达,进而引起血管平滑肌细胞发生了凋亡。

本研究给予高磷刺激,观察细胞增殖凋亡情况。 MTT 结果提示高磷刺激的血管平滑肌细胞增殖显著减弱,流式检测结果提示高磷刺激的血管平滑肌细胞发生了凋亡。 有研究表明,高磷可诱导血管平滑肌细胞发生凋亡,与本研究结果一致[10]。 高磷诱导发生凋亡的血管平滑肌细胞中miR-30b 表达显著降低,促进凋亡蛋白BAX 表达显著升高,抑凋亡蛋白Bcl-2 表达显著降低。 表明miR-30b 参与了高磷诱导的VSMCs 的凋亡过程。

miRNAs 是一类小的内源性非编码RNA,长约18~24 个核苷酸,具有调控功能,通过调节细胞增殖、分化、凋亡等多种生物学过程调控血管钙化[11]。研究发现miRNA30 家族参与调控血管钙化[12-13]。有关人结直肠癌的研究发现miR-30b 可诱导细胞周期G1 的停止和细胞凋亡[14]。 有关人主动脉瓣的研究发现miR-30b 是主动脉瓣间质细胞的多功能调节器[6]。 Xu 等[15]在人肺成纤维细胞WI-38 细胞实验中,下调miR-30b 后人肺成纤维细胞WI-38 细胞的BAX 表达升高,凋亡增加。 有研究证实,BAX 被激活并转移到线粒体,引起线粒体外膜通透化,导致细胞破坏,诱导凋亡[16]。 BAX 和Bcl-2 是一对正负凋亡调节因子,BAX 起促进凋亡作用,Bcl-2 起抗凋亡作用[17]。 本研究为探究miR-30b 与VSMCs 凋亡的关系,给予转染miR-30b 的抑制物,结果显示,转染miR-30b 的抑制物后,流式检测结果及MTT 显示,VSMCs 凋亡细胞增多、增殖显著降低;促凋亡蛋白BAX 上调、抑凋亡蛋白Bcl-2 的表达明显下降,表明miR-30b 抑制物能够上调BAX,下调Bcl-2,促进了VSMCs 发生凋亡。

综上,本研究在体外实验中发现高磷可促进血管平滑肌细胞发生凋亡,可能机制是通过抑制miR-30b 表达,促进BAX 表达,抑制Bcl-2 表达,进而导致VSMCs 发生凋亡。