山豆根多糖对PCV2感染小鼠脾淋巴细胞炎症因子m RNA表达的影响

2022-08-16贾妮娜张铭林丁伊曲胡庭俊

现代畜牧兽医 2022年6期

贾妮娜，张铭林，丁伊曲，胡庭俊

（广西大学动物科学技术学院，广西南宁 530005）

山豆根作为一种天然中药，最初记载于《开宝本草》。2020版《中国药典》中记载，山豆根具有清火解毒、消肿止痛等功效[1]。山豆根多糖（SSP）是山豆根的有效成分之一。研究表明，SSP可以增强机体免疫功能，具有抗炎、抗病毒和抗氧化等作用[2-3]。目前，已知猪圆环病毒2型（PCV2）感染导致的机体免疫抑制可能是由病毒刺激机体产生炎性反应所致。因此，降低PCV2感染后产生的炎症至关重要[4]。本试验拟建立PCV2感染小鼠脾淋巴细胞的炎症模型，利用SSP降低PCV2感染后导致的炎症，探索合适的药物浓度和作用时间，为后续抗PCV2的药物开发提供思路。

实验室前期观察了不同浓度（25~1 600 mg/L）的SSP对小鼠脾淋巴细胞活性的影响，发现当SSP浓度低于400 mg/L时对小鼠脾淋巴细胞的活力无显著影响；PCV2感染小鼠后，细胞活力显著降低，并在48 h后显著下降；而经SSP处理后，细胞活性在12 h开始升高，且在72 h内，随着时间增加细胞活性也不断升高。基于此，本试验选择使用100、200和400 mg/L的SSP处理经PCV2感染的小鼠脾淋巴细胞，并在8、12和24 h收取样品检测细胞中炎性因子的mRNA表达水平，探究SSP对PCV2感染小鼠脾淋巴细胞模型最佳给药剂量和时间，为后续试验打下基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 试验药品

SSP由广西大学动物科学技术学院兽医药理与毒理学教研室制备，多糖中总糖含量为91.50%。

1.1.2 试验动物

SPF级昆明种小鼠，4周龄，体重为（20±2）g，购自广西医科大学实验动物中心。购入后适养3~7 d，期间饮水及采食自由。

1.1.3 主要试剂

胎牛血清（FBS）、RPMI-1640培养基（Gibco公司）；PBS（南京生航生物技术有限公司）；青、链霉素混合液及红细胞裂解液（索莱宝试剂公司）；细胞筛（SORFA公司）、RNAiso Plus（Takara公司）；All-In-One 5×RT MasterMix、BlasTaqTM2×qPCRMasterMix（abm公司）。

1.1.4 主要仪器

电子分析天平（Mettler Toledo公司）；Centrifuge 5418离心机（Eppendorf公司）；梯度PCR仪（BIO-RAD公司）；Roche LightCycler®96实时荧光定量PCR仪（Roche公司）。

1.2 试验方法

1.2.1 小鼠脾淋巴细胞的制备

小鼠颈椎脱臼处死，75%酒精浸泡2 min，取出小鼠置于无菌皿；超净台内低温取出脾脏，放入盛有预冷的适量PBS液的培养皿中清洗。

将脾脏放置于40μm细胞筛网上，PBS冲洗新鲜脾脏，采用5 mL注射器针芯研磨脾脏，培养皿收集筛网滤下的脾研磨液，并转移至15 mL离心管中。

加入红细胞裂解液，置于冰上裂解15 min，期间每隔5 min轻摇一次；800 r/min离心5 min，弃除上清；加入PBS轻轻吹打混匀沉淀细胞，将细胞团块吸出弃除，800 r/min离心5 min，弃除上清；再次加入PBS后800 r/min离心5 min，弃去上清；加入含10%胎牛血清的RPMI-1640培养液，轻轻吹打混匀，经40μm筛网过滤去除细胞团块，悬浮沉淀细胞，收集细胞滤液。

1.2.2 试验设计

试验设置细胞对照组、PCV2感染对照组、PCV2＋SSP100组（PCV2＋100 mg/L SSP）、PCV2＋SSP200组（PCV2＋200 mg/L SSP）、PCV2＋SSP400组（PCV2＋400 mg/L SSP）、SSP400组（400 mg/L SSP），共6组，每组3个重复。

将细胞滤液接种于6孔板内，每孔2 mL，置于37℃、5%CO2条件下培养6 h后，6组均吸弃1.5 mL上清液，细胞对照组和SSP400组在细胞液中加入1 mL RPMI-1640培养基；PCV2感染对照组、PCV2＋SSP100组、PCV2＋SSP200组、PCV2＋SSP400组加入1 mL PCV2病毒液（感染剂量103TCID50）。于37℃、5%CO2、饱和湿度条件下孵育2 h。

PCV2＋SSP400组、SSP400组各组分别加入1.5 mL含800 mg/L SSP的10%FBS-RPMI-1640完全培养液；PCV2＋SSP100组、PCV2＋SSP200组各组分别加入1.5 mL含200和400 mg/L SSP的10%FBS-RPMI-1640完全培养液；细胞对照组和PCV2感染对照组加入1.5 mL的10%FBS-RPMI-1640完全培养液。于37℃、5%CO2条件下分别继续培养8、12和24 h。试验分组及处理见表1。

表1 试验分组及处理Tab.1 Grouping and processing of experiment

1.2.3 样品收集

从细胞培养箱中取出细胞培养板，轻轻挪至超净台上，保持液面静止。将上层液体缓慢吸出，约留下1 mL，吸取剩余培养基轻轻吹打沉降在6孔板底部的细胞。将细胞连同剩余的培养基装入RNase Free EP管中，1 500 r/min 4℃离心5 min，弃上清；每管加入1 mL PBS吹散，再次1 500 r/min 4℃离心5 min，弃上清，加入1 mL的RNAiso Plus，反复吹吸，直至裂解液中无明显沉淀，静置5 min，转移至-80℃保存。

1.2.4 总RNA提取及cDNA合成

将1.2.3中收集的样品按RNAiso Plus试剂说明书进行提取。提取后采用超微量分光光度计对RNA的吸光度（OD值）进行检测，OD260/280范围在1.8~2.6之间视为RNA质量合格。

采用琼脂糖凝胶电泳检测RNA完整性，配置1%琼脂糖凝胶，每孔加入2.5μL RNA样品和2.5μL 2×RNA Loading Buffer；电压180 V，电流120 A，电泳12 min；使用凝胶成像系统观察结果，存在3条清晰、明亮的条带，RNA可进行反转录。

检测合格的RNA按照All-In-One 5×RT MasterMix反转录试剂盒说明书进行反转录，得到的cDNA于-20℃冷冻保存。

1.2.5 荧光定量PCR检测炎症因子相关基因表达

试验中所用的mRNA引物由南宁捷尼斯生物科技有限公司设计与合成，引物序列见表2。

表2 mRNA特异性引物序列Tab.2 Primer sequenceof mRNA

Q-PCR反应体系（20μL）：BlasTaqTM2×qPCR MasterMix 10μL、上游引物0.5μL、下游引物0.5μL、cDNA模板1μL、ddH2O 8μL。

Q-PCR扩增条件：95℃预变性3 min；95℃变性15 s，60℃退火/延伸60 s，共40个循环；溶解曲线95℃10 s，65℃60 s，97℃1 s；37℃冷却30 s。

1.3 数据统计与分析

以β-actin作为内参基因，每个样本设置两个复孔，采用2-△△Ct法进行相对定量分析，并将细胞对照组中目的基因的表达水平设置为1。试验数据采用SPSS22.0软件进行单因素方差分析（One-way ANOVA）。结果以“平均值±标准差”表示，P<0.05表示差异显著。

2 结果与分析

2.1 感染8 h后SSP对PCV2感染脾淋巴细胞炎症因子mRNA表达水平的影响（见表3）

表3 感染8 h后SSP对PCV2感染脾淋巴细胞炎症因子mRNA表达水平Tab.3 Effect of SSPon expression level of inflammatory factor in spleen lymphocytesat 8 h post PCV2-infection

由表3可知，在PCV2感染小鼠脾淋巴细胞8 h后，PCV2感染对照组的各炎症因子的表达水平与细胞对照组相比均有所下降，其中NF-κB、MCP-1和STAT1的表达水平与细胞对照组相比显著下调（P<0.05）。

在给予不同浓度的SSP后，NF-κB、MCP-1和STAT1的表达水平仍有所下降；与PCV2感染对照组相比，各组STAT1的表达水平均显著降低（P<0.05），SSP400组的NFκB表达水平显著降低（P<0.05）。6个处理组CXCL10的表达水平差异均不显著（P>0.05）。

2.2 感染12 h后SSP对PCV2感染脾淋巴细胞炎症因子mRNA表达水平的影响（见表4）

由表4可知，在PCV2感染小鼠脾淋巴细胞12 h后，PCV2感染对照组的各炎症因子的表达水平与细胞对照组相比均显著下降（P<0.05）。

表4 感染12 h后SSP对PCV2感染脾淋巴细胞炎症因子mRNA表达水平的影响Tab.4 Effect of SSPon expression level of inflammatory factor in spleen lymphocytes at 12 h post PCV2-infection

在给予不同浓度的SSP后，MCP-1、CXCL10、STAT1的表达水平均有所降低。与PCV2感染对照组相比，PCV2＋SSP400组、SSP400组NF-κB的表达水平显著上升（P<0.05）；SSP400组MCP-1的表达水平显著升高（P<0.05）。CXCL10的表达水平随着SSP添加水平升高逐步降低，PCV2＋SSP200组和PCV2＋SSP400组的表达水平显著低于PCV2感染对照组和细胞对照组（P<0.05）。STAT1的mRNA表达水平在经SSP处理后先降低后升高，PCV2＋SSP200组和PCV2＋SSP400组的表达水平显著低于PCV2感染对照组和细胞对照组（P<0.05）。

2.3 感染24 h后SSP对PCV2感染脾淋巴细胞炎症因子mRNA表达水平的影响（见表5）

由表5可知，在PCV2感染小鼠脾淋巴细胞24 h后，显著升高了细胞内NF-κB、MCP-1、CXCL10和STAT1的mRNA表达水平（P<0.05），表明PCV2感染小鼠脾淋巴细胞的炎症模型建立成功。

表5 感染24 h后山豆根多糖对PCV2感染脾淋巴细胞炎症因子mRNA表达水平的影响Tab.5 Effect of SSPon expression level of inflammatory factor in spleen lymphocytes at 24 h post PCV2-infection

经过不同浓度的SSP处理后，各组炎症因子的mRNA表达水平均有所降低。与PCV2感染对照组相比，小鼠脾淋巴细胞MCP-1的表达水平经100、200和400 mg/L的SSP处理后均显著降低（P<0.05）。NF-κB、CXCL10和STAT1表达水平经100 mg/L的SSP处理后与PCV2感染对照组相比差异均不显著（P>0.05）；经200和400 mg/L的SSP处理后的小鼠脾淋巴细胞与PCV2感染对照组相比均显著降低（P<0.05）。小鼠脾淋巴细胞感染PCV2后，NF-κB、MCP-1、CXCL10和STAT1等4种炎症因子的表达水平在经400 mg/L的SSP处理后与PCV2感染对照组相比均显著降低（P<0.05）。

综上所述，SSP对于炎症因子mRNA表达水平呈现一定的剂量依赖，SSP的浓度越高，对于炎症因子表达的抑制效果越明显。

3 讨论

猪圆环病毒（PCV）是一种单链、无囊膜的环状DNA病毒，目前已发现4种基因型：PCV1、PCV2、PCV3和PCV4[5-6]。其中PCV2的致病性最强，传播也最为广泛，由PCV2所引起的病症被统称为猪圆环病毒相关疾病（porcine circovirus associated disease，PCVD）[7]，常与其他多种病原体混合感染[8]，加重临床严重程度。目前对PCV2的治疗仅停留于常规手段，防范手段也以疫苗免疫为主。但PCV2突变率极高，感染后会导致免疫抑制[9]，使疫苗失效。因此，养殖业需要一种新的手段防治PCV2。

多糖是一种从植物、藻类和动物等中分离出的天然高分子聚合物[10-11]。近年来，多糖的多种生物活性被不断发掘，在安全、环保、无耐药性的同时，多糖还具有调节机体免疫和代谢等功效。

此外，多糖还被证明具有抗炎和抗病毒等药理作用[12]。黄贤能等[13]研究发现，柴胡多糖能够降低LPS诱导的RAW264.7细胞炎症模型中一氧化氮（NO）的含量，起到抗炎的效果。钟敏等[14]将正北芪多糖作用于结肠炎小鼠模型，结果发现，正北芪多糖能够减少肠组织的溃疡面积和炎性细胞浸润，并且降低小鼠体内IL-6、IL-1β和TNF-α等炎性因子的含量，通过改善肠道黏膜屏障和减少炎症因子释放，进而缓解小鼠结肠炎的症状。刘丹华等[15]对黄芪多糖在LPS诱导的鸡胚成纤维细胞系DF-1炎症中的作用进行了研究，结果发现，单独使用黄芪多糖处理DF-1细胞能够促进IL-1β和TNF-α的释放，从而增强免疫功能；在给予LPS刺激后再使用黄芪多糖进行处理，结果显示，黄芪多糖能够通过抑制IL-1β和TNF-α的释放起到抗炎的作用。马升等[16]研究发现，金针菇多糖能增强RAW264.7细胞的吞噬能力，通过抑制NF-κB-NLRP3信号通路的激活抑制巨噬细胞炎症反应。

本试验中采用PCV2建立小鼠脾淋巴细胞的体外炎症模型，在培养体系中分别加入100、200和400 mg/L的山豆根多糖继续培养8、12和24 h；荧光定量PCR结果表明，当PCV2感染后24 h时，小鼠脾淋巴细胞内NF-κB、CXCL10和STAT1的mRNA表达水平高于细胞对照组；3种不同浓度的山豆根多糖处理后均能够降低炎性因子的表达水平，并随着剂量的升高炎性因子的表达水平越低，其中以400 mg/L的SSP的效果最佳。结果表明，400 mg/L的山豆根多糖作用于PCV2感染的小鼠脾淋巴细胞24 h后能够降低细胞内炎症因子的mRNA表达，起到抗炎的效果。