醴肠化学成分及其抗沙门菌T3SS的活性成分研究

张晓春，鲁春华

醴肠化学成分及其抗沙门菌T3SS的活性成分研究

张晓春，鲁春华*

山东大学齐鲁医学院，山东大学药学院 天然药物化学研究所，山东 济南 250012

研究醴肠的化学成分及其抗沙门菌Ⅲ型分泌系统（type III secretion system，T3SS）活性。综合运用Sephadex LH-20凝胶、正相硅胶、HPLC、中压反相等柱色谱方法进行分离纯化，MS、NMR、UV、IR等技术进行结构鉴定，采用SDS-PAGE法检测化合物1～18抗沙门菌T3SS毒力蛋白分泌活性。从醴肠全草提取物中分离到18个化合物，分别鉴定为香豌豆酚（1）、3′--甲基香豌豆酚（2）、蟛蜞菊内酯（3）、异去甲蟛蜞菊内酯（4）、木犀草素（5）、5′-(4-羟基-1-丁炔-1-基)[2,2′-联噻吩]-5-醛（6）、α-三联噻吩（7）、α-三联噻吩甲醛（8）、α-三联噻吩甲醇（9）、5-甲氧亚甲基-2,2′:5′,2′′-三联噻吩（10）、5-羟甲基-(2,2′:5′,2′′)-三联噻吩乙酯（11）、[2,2′:5′,2′′-三联噻吩]-5-基甲基-2-甲基丁酯（12）、5-羟甲基-(2,2′:5′,2′′)-噻吩当归酸酯（13）、5-羟甲基-(2,2′:5′,2′′)-噻吩巴豆酸酯（14）、()-[2,2′-联噻吩]-5-甲醇-5′-(3-丁烯-1-炔基)-2-巴豆酸酯（15）、()-5′-(3-丁烯-1-炔基)-[2,2′-噻吩]-5-甲醇-2-甲基巴豆酸酯（16）、5′-(3-丁烯-1-炔-1-基)-[2,2′-联噻吩]-5-甲醇-5-乙酯（17）和5′-羟甲基-5-(3-丁烯-1-炔基)-2,2′-联噻吩（18）。化合物6、15、16首次从植物醴肠中分离得到。化合物5具有较强的沙门菌T3SS毒力蛋白分泌抑制活性，化合物1、3、4具有一定的抗T3SS活性，为醴肠民间用作排脓、止血、治热痢以及抗菌抗感染药物提供了科学的理论基础。

醴肠；抗沙门菌T3SS活性；抗毒力药物；噻吩；黄酮；5′-(4-羟基-1-丁炔-1-基)[2,2′-联噻吩]-5-醛；()-[2,2′-联噻吩]-5-甲醇-5′-(3-丁烯-1-炔基)-2-巴豆酸酯；木犀草素

抗毒力疗法是治疗感染的一种新策略，在不影响细菌生长的情况下，干扰并抑制病原菌的毒力因子，降低其致病性。这些毒力因子主要参与细菌定殖、黏附，突破机体防御屏障，在宿主细胞内生存、增殖、扩散。当前抗毒力药物研究方向主要包括阻止细菌生物被膜形成，阻止细菌黏附，抑制分泌系统合成、组装等[1-2]。目前已发现9种细菌分泌系统，其中Ⅲ型分泌系统（type III secretion system，T3SS）是包括沙门菌在内的许多革兰阴性致病菌最重要的毒力系统，成为抗毒力药物重要的靶标[3]。因此，T3SS抑制剂的发现已成为治疗感染的一种新途径，在耐药性方面具有比传统抗生素更大的优势[4]。药用植物具备来源广、化学成分多样、方便易得等多种优势，为抗毒力药物的发现提供了天然宝库，是T3SS抑制剂的重要来源[5]。Zhang等[6]研究发现唇形科植物百里香中分离得到的百里香酚能够抑制沙门菌对HeLa细胞的侵袭，保护小鼠免受沙门菌感染，是一种潜在的T3SS抑制剂；Vikram等[7]对柑橘中的柚皮素进行研究，发现能够抑制沙门菌毒力岛SPI-1，显著降低沙门菌毒力和致病性。从药用植物中筛选抗沙门菌T3SS活性成分，已被证实是一种有效的治疗感染、对抗细菌耐药的方法。

本课题组前期对50种缅甸蔬菜进行了抗毒力活性筛选，发现醴肠全草提取物能够显著地抑制沙门菌T3SS毒力蛋白的分泌，是抗毒力药物发现的潜在资源，值得深入研究。醴肠L.是菊科醴肠属植物，一年生草本，又名墨旱莲。分布于热带、亚热带地区，在我国广泛分布，是一种常见中草药[8]。已有研究表明，醴肠提取物及化合物具有排脓、止血、治热痢以及抗菌抗感染等功效[9-11]。为深入研究醴肠中通过抗毒力而抗感染抗菌的活性成分，本实验对醴肠全草提取物进行了成分的分离，共得到18个化合物，分别鉴定为香豌豆酚（orobol，1）、3′--甲基香豌豆酚（3′--methyl orobol，2）、蟛蜞菊内酯（wedelolactone，3）、异去甲蟛蜞菊内酯（isodemethyl wedelolactone，4）、木犀草素（luteolin，5）、5′-(4-羟基-1-丁炔-1-基)[2,2′-联噻吩]-5-醛（5′-(4-hydroxy-1-butyn-1-yl)[2,2′- bithiophene]-5-carboxaldehyde，6）、α-三联噻吩（α-terthienyl，7）、α-三联噻吩甲醛（α-formyl- terthienyl，8）、α-三联噻吩甲醇（α-terthienyl methanol，9）、5-甲氧亚甲基-2,2′:5′,2′′-三联噻吩 [5- (methoxymethyl)-(2,2′:5′,2′′)-terthiophene，10]、5-羟甲基-(2,2′:5′,2′′)-三联噻吩乙酯 [5-hydroxymethyl- (2,2′:5′,2′′)-terthienyl acetate，11]、[(2,2′:5′,2′′)-三联噻吩]-5-基甲基-2-甲基丁酯（[(2,2′:5′,2′′)-terthiophen]- 5-ylmethyl 2-methylbutanoate，12）、5-羟甲基- (2,2′:5′,2′′)-噻吩当归酸酯[5-hydroxymethyl- (2,2′:5′,2′′)-terthienyl angelate，13]、5-羟甲基- (2,2′:5′,2′′)-噻吩巴豆酸酯[5-hydroxymethyl- (2,2′:5′,2′′)-terthienyl tiglate，14]、()-[2,2′-联噻吩]-5-甲醇-5′-(3-丁烯-1-炔基)-2-巴豆酸酯（(Z)-5′-(3-buten-1-ynyl)-[2,2′-bithiophene]-5-methanol- 2-methylcrotonate，15）、()-5′-(3-丁烯-1-炔基)-[2,2′-噻吩-5-甲醇-2-甲基巴豆酸酯（()-5′-(3-buten-1- ynyl)-[2,2′-bithiophene]-5-methanol-2-methylcrotonate，16）、5′-(3-丁烯-1-炔-1-基)-[2,2′-联噻吩]-5-甲醇-5-乙酯（5′-(3-buten-1-yn-1-yl)-[2,2′-bithiophene]-5- methanol-5-acetate，17）和5′-羟甲基-5-(3-丁烯-1-炔基)-2,2′-联噻吩[5′-hydroxymethyl-5-(3-buten-1- ynyl)-2,2′-bithiophene，18]，其中化合物6、15、16首次从植物醴肠中分离得到；抗毒力活性筛选发现化合物1、3、4和5具有抑制沙门菌T3SS毒力蛋白分泌的活性，其中化合物5表现出最强的抗毒力活性。

1 仪器与材料

400 MHz、600 MHz核磁共振波谱仪（德国Bruker公司）；SBS-100数控计滴自动部分收集器（上海沪西分析仪器厂有限公司）；分析型高效液相色谱仪（美国Agilent科技公司）；制备型高效液相色谱仪（美国Waters公司）；中压液相色谱仪（瑞士 BUCHI公司）；BSA-2245W型电子天平（德国Sartorius公司）；TU-1810型紫外可见光分光光度计（北京普析通用仪器公司）；凝胶成像仪（美国Bio-Rad公司）；电泳仪（美国Bio-Rad公司）；氘代试剂（上海新铂化学有限公司）；色谱级乙腈、甲醇（广州艾欣科技有限公司）；薄层色谱硅胶板（烟台江友硅胶开发有限公司）；葡聚糖凝胶（GE Healthcare公司）；三氯乙酸（TCA，Aladdin公司）；cytosporone B（CsnB，上海毕得医药公司，CAS 321661-62-5；产品编码 BP4078）；反相硅胶（德国Merck公司）；实验用分析纯溶剂（天津富宇试剂公司）；ESI-MS质谱仪（美国Finnigan公司）。

供试菌株：减毒鼠伤寒沙门菌（UK-1χ8956）由美国亚利桑那州立大学惠赠，−80 ℃保存于本实验室。

药材采集自山东省郓城县城南，由中国科学院昆明植物研究所杨雪飞研究员鉴定为醴肠L. 全草。

2 方法

2.1 提取与分离

取干燥醴肠全草1.0 kg，粉碎后用95%乙醇水提取液浸泡，提取3次，合并提取液，35 ℃减压浓缩至干得到乙醇粗提物。用95%甲醇水溶液200 mL溶解粗提物后，加入100 mL石油醚进行萃取，共萃取4～5次，合并萃取液，35 ℃减压浓缩至干，得到石油醚萃取物和甲醇萃取物。甲醇萃取物用醋酸乙酯-水（1∶1）萃取3～4次，35 ℃减压浓缩至干得到醋酸乙酯萃取物和水萃取物。

醋酸乙酯萃取物（13.5 g）经葡聚糖凝胶柱色谱分离，甲醇洗脱，合并洗脱液得Fr. A～D。Fr. B（2.65 g）先后经正相硅胶柱色谱、葡聚糖凝胶柱色谱分离共得到7个组分Fr. B1～B7。Fr. B5（100.7 mg）经正相硅胶柱色谱以石油醚-醋酸乙酯（20∶1→0∶1）进行梯度洗脱，根据薄层色谱（TLC）检测结果，合并洗脱液得到化合物4（4.5 mg）。Fr. B6（38.4 mg）经正相硅胶柱色谱，以石油醚-醋酸乙酯（100∶1→10∶1）梯度洗脱，得到化合物6（1.9 mg）；Fr. B7（11.5 mg）经正相硅胶柱色谱，石油醚-醋酸乙酯（50∶1→5∶1）分离得到化合物3（4.5 mg）。

组分Fr. D（2.25 g）再次进行葡聚糖凝胶柱色谱分离，二氯甲烷-甲醇（1∶2）洗脱，根据TLC检测结果得到Fr. D1～D3。Fr. D1（559.3 mg）经中压反相柱（RP-18）色谱分离，以10%～100%乙腈梯度洗脱共得到3个组分Fr. D1-1～D1-3。Fr. D1-2（56.8 mg）经正相硅胶柱色谱以石油醚-醋酸乙酯（20∶1→0∶1）进行梯度洗脱，根据TLC检测合并相同组分，得到化合物1（4.7 mg）、5（12.4 mg）。Fr. D3（112.6 mg）经葡聚糖凝胶柱色谱（甲醇）分离，合并相同流分共得到3个组分Fr. D3-1～D3-3，Fr. D3-2（28.5 mg）经正相硅胶柱色谱分离，石油醚-醋酸乙酯（10∶1）梯度洗脱，得到化合物2（3.6 mg）。

取石油醚萃取物（8.8 g）经葡聚糖凝胶柱色谱分离，以二氯甲烷-甲醇（1∶2）洗脱，根据TLC检测结果，合并为Fr. 1～3。Fr. 2（3.0 g）经葡聚糖凝胶柱色谱，二氯甲烷-甲烷（1∶2）洗脱，合并为Fr. 2A～2E。Fr. 2C（67.7 mg）经正相硅胶柱色谱以石油醚-丙酮（100∶1→10∶1）梯度洗脱，得到Fr. 2C1～2C4 共4个组分。Fr. 2C3（60.3 mg）经半制备型HPLC [乙腈-水（85∶15），4 mL/min] 分离，得到化合物13（3.3 mg，R= 13.2 min）、14（4.5 mg，R= 12.7 min）、18（2.3 mg，R= 15.1 min）、11（3.2 mg，R= 8.1 min）和10（1.5 mg，R= 8.8 min）。Fr. 2D（278.4 mg）经葡聚糖凝胶柱色谱，二氯甲烷-甲醇（1∶2）洗脱，得9个组分，即Fr. 2D1～2D9。Fr. 2D7（23.5 mg）经正相硅胶柱色谱以石油醚-醋酸乙酯（1∶0→10∶1）洗脱，根据TLC检测结果，得到化合物8（2.3 mg）。Fr. 2D8（32.3 mg）经正相硅胶柱色谱以石油醚-醋酸乙酯（1∶0→0∶1）洗脱，合并得化合物7（4.6 mg）和9（3.5 mg）。

Fr. 3（556.9 mg）经正相硅胶柱色谱以石油醚-醋酸乙酯（100∶1→10∶1）梯度洗脱，得Fr. 3A～3C。Fr. 3B经半制备型HPLC [乙腈-水（80∶20），4 mL/min] 分离，得化合物17（3.3 mg，R= 6.1 min）、15（3.2 mg，R= 12.3 min）、16（1.9 mg，R= 13.5 min）和12（2.2 mg，R= 15.6 min）。

2.2 活性筛选[12]

利用温度变化诱导鼠伤寒沙门菌T3SS毒力蛋白SipA、B、C、D分泌，以TCA-丙酮（−20 ℃保存）沉淀毒力蛋白，将蛋白变性后进行SDS-PAGE检测，筛选能够抑制毒力蛋白分泌的化合物。具体方法：将28 ℃过夜培养的UK-1χ8956用添加-阿拉伯糖（0.2%）的LB培养基稀释100倍，加入样品（终浓度为100 μmol/L）后，在37 ℃、220 r/min条件下培养5～6 h，以加入DMSO组作为对照组，加入CsnB的作为阳性对照组。在4 ℃离心后从上清液中获得分泌蛋白，加入100%TCA在冰上放置30 min使蛋白沉淀，在4 ℃、12 000 r/min离心10 min，控干TCA后，加入400 μL冰丙酮洗涤。在12 000 r/min离心15 min，倒掉上清，待丙酮挥干后加入20 μL的1×loading buffer，在95 ℃恒温加热5 min使蛋白变性，取蛋白样品8 μL进行SDS-PAGE检测。

3 结果

3.1 结构鉴定

化合物1：黄色粉末；ESI-MS287.2 [M＋H]+，确定相对分子质量为286；分子式为C15H10O6；1H-NMR (400 MHz, CDCl3): 8.02 (1H, s, H-2), 7.02 (1H, d,= 1.7 Hz, H-2′), 6.86 (1H, dd,= 8.2, 1.8 Hz, H-6′), 6.83 (1H, d,= 8.1 Hz, H-5′), 6.33 (1H, d,= 2.1 Hz, H-8), 6.21 (1H, d,= 2.2 Hz, H-6)；13C-NMR (400 MHz, CDCl3): 180.8 (C-4), 164.5 (C-7), 163.5 (C-5), 158.3 (C-9), 153.4 (C-2), 145.4 (C-4′), 144.8 (C-3′), 123.4 (C-3), 122.4 (C-1′), 120.3 (C-6′), 116.0 (C-2′), 114.9 (C-5′), 104.9 (C-10), 98.7 (C-6), 93.4 (C-8)。以上数据与文献报道基本一致[13]，故鉴定化合物1为香豌豆酚。

化合物2：黄色粉末；ESI-MS301.4 [M＋H]+，确定相对分子质量为300；分子式为C16H12O6；1H-NMR (400 MHz, CDCl3): 8.11 (1H, s, H-2), 7.18 (1H, d,= 1.8 Hz, H-2′), 7.0 (1H, dd,= 8.2, 2.0 Hz, H-6′), 6.88 (1H, d,= 8.2 Hz, H-5′), 6.37 (1H, d,= 2.1 Hz, H-8), 6.25 (1H, d,= 2.1 Hz, H-6), 3.91 (3H, s, 3′-OCH3)；13C-NMR (400 MHz, CDCl3): 180.8 (C-4), 164.9 (C-7), 162.1 (C-5), 158.3 (C-9), 153.6 (C-2), 147.4 (C-3′), 146.5 (C-4′), 123.3 (C-3), 122.4 (C-1′), 121.5 (C-6′), 114.8 (C-5′), 112.6 (C-2′), 104.8 (C-10), 98.8 (C-6), 93.4 (C-8), 55.1 (3′-OCH3)。以上数据与文献报道基本一致[13]，故鉴定化合物2为3′--甲基香豌豆酚。

化合物3：黄色粉末；ESI-MS315.3 [M＋H]+，确定相对分子质量为314；分子式为C16H10O7；1H-NMR (400 MHz, CDCl3): 8.14 (1H, s, H-10), 7.59 (1H, s, H-13), 6.67 (1H, d,= 2.1 Hz, H-6), 6.65 (1H, d,= 2.1 Hz, H-8), 3.72 (3H, s, 7-OCH3)；13C-NMR (400 MHz, CDCl3): 166.4 (C-7), 161.5 (C-1), 159.4 (C-9), 156.8 (C-5), 156.8 (C-3), 150.8 (C-15), 147.7 (C-11), 146.7 (C-12), 115.8 (C-14), 106.5 (C-10), 103.6 (C-2), 100.1 (C-13), 99.0 (C-8), 98.9 (C-4), 92.4 (C-6), 55.9 (7-OCH3)。以上数据与文献报道基本一致[14]，故鉴定化合物3为蟛蜞菊内酯。

化合物4：黄色粉末；ESI-MS301.3 [M＋H]+，确定相对分子质量为300；分子式为C15H8O7；1H-NMR (400 MHz, CDCl3): 8.15 (1H, s, H-10), 7.60 (1H, s, H-13), 6.69 (1H, d,= 2.2 Hz, H-8), 6.68 (1H, d,= 2.2 Hz, H-6)；13C-NMR (400 MHz, CDCl3): 163.4 (C-7), 160.5 (C-1), 159.3 (C-9), 156.8 (C-3), 156.7 (C-5), 150.8 (C-15), 147.7 (C-11), 146.6 (C-12), 115.8 (C-14), 106.6 (C-10), 103.6 (C-2), 100.0 (C-13), 99.4 (C-8), 98.9 (C-4), 93.7 (C-6)。以上数据与文献报道基本一致[14]，故鉴定化合物4为异去甲基蟛蜞菊内酯。

化合物5：黄色粉末；ESI-MS287.2 [M＋H]+，确定相对分子质量为286；分子式为C15H10O6；1H-NMR (400 MHz, CDCl3): 7.29 (1H, dd,= 8.2, 2.2 Hz, H-6′), 7.27 (1H, d,= 2.0 Hz, H-2′), 6.81 (1H, d,= 9.0 Hz, H-5′), 6.43 (1H, s, H-3), 6.33 (1H, d,= 2.0 Hz, H-8), 6.10 (1H, d,= 2.0 Hz, H-6)；13C-NMR (400 MHz, CDCl3): 182.4 (C-4), 164.9 (C-9), 164.7 (C-2), 161.8 (C-5), 158.0 (C-7), 149.6 (C-4′), 145.6 (C-3′), 122.3 (C-1′), 118.9 (C-6′), 115.4 (C-5′), 112.7 (C-2′), 103.9 (C-10), 102.4 (C-3), 98.7 (C-6), 93.6 (C-8)。以上数据与文献报道基本一致[15]，故鉴定化合物5为木犀草素。

化合物6：灰白色粉末；ESI-MS263.1 [M＋H]+，确定相对分子质量为262；分子式为C13H10O2S2；1H-NMR (400 MHz, CDCl3): 9.86 (1H, s, 5′-CHO), 7.67 (1H, d,= 4.0 Hz, H-3), 7.23 (1H, d,= 4.0 Hz, H-4) 7.20 (1H, d,= 3.8 Hz, H-3′), 7.10 (1H, d,= 3.9 Hz, H-4′), 3.85 (2H, dd,= 10.7, 5.1 Hz, H-9), 2.76 (2H, dd,= 11.1, 5.3 Hz, H-8)；13C-NMR (400 MHz, CDCl3): 146.5 (C-5′), 140.3 (C-2), 137.2 (C-2′), 134.3 (C-4), 126.9 (C-4′), 125.0 (C-3′), 124.3 (C-3), 122.4 (C-5), 93.4 (C-7), 74.8 (C-6), 60.9 (C-9), 24.2 (C-8)。以上数据与文献报道基本一致[16]，故鉴定化合物6为5′-(4-羟基-1-丁炔-1-基) [2,2′-联噻吩]-5-醛。

化合物7：黄色粉末；ESI-MS249.4 [M＋H]+，确定相对分子质量为248；分子式为C12H8S3；1H-NMR (400 MHz, CDCl3): 7.18 (2H, dd,= 3.6, 1.0 Hz, H-3, 3′′), 7.23 (2H, dd,= 5.1, 1.1 Hz, H-5, 5′′), 7.08 (2H, s, H-3′, 4′), 7.03 (2H, dd,= 5.1, 3.6 Hz, H-4, 4′′)；13C-NMR (400 MHz, CDCl3): 137.1 (C-2, 2′′), 136.2 (C-2′, 5′), 127.9 (C-4, 4′′), 124.5 (C-5, 5′′), 124.3 (C-3′, 4′), 123.7 (C-3, 3′′)。以上数据与文献报道基本一致[17]，故鉴定化合物7为α-三联噻吩。

化合物8：棕黄色粉末；ESI-MS277.2 [M＋H]+，确定相对分子质量为276；分子式为C13H8OS3；1H-NMR (400 MHz, CDCl3): 9.86 (1H, s, H-6), 7.68 (1H, d,= 4.0 Hz, H-4), 7.29 (1H, d,= 4.0 Hz, H-5′′), 7.27 (1H, d,= 3.8 Hz, H-3), 7.25 (1H, d,= 3.9 Hz, H-3′′), 7.24 (1H, d,= 3.9 Hz, H-3′), 7.14 (1H, d,= 3.9 Hz, H-4′), 7.06 (1H, dd,= 5.0, 3.7 Hz, H-4′′)；13C-NMR (400 MHz, CDCl3): 182.4 (C-6), 146.8 (C-2), 141.6 (C-5), 139.2 (C-2′′), 137.4 (C-4), 136.4 (C-5′), 134.5 (C-2′), 128.1 (C-4′′), 126.9 (C-5′′), 125.4 (C-3′′), 124.7 (C-4′), 124.5 (C-3′), 124.0 (C-3)。以上数据与文献报道基本一致[18]，故鉴定化合物8为α-三联噻吩甲醛。

化合物9：棕黄色粉末；ESI-MS279.1 [M＋H]+，确定相对分子质量为278；分子式为C13H10OS3；1H-NMR (400 MHz, acetone6): 7.23 (1H, d,= 5.1 Hz, H-5′′), 7.18 (1H, d,= 3.6 Hz, H-3), 7.08 (1H, d,= 3.8 Hz, H-3′), 7.06 (1H, d,= 3.9 Hz, H-4′), 7.04 (1H, d,= 3.5 Hz, H-3′′), 7.03 (1H, dd,= 5.1, 3.8 Hz, H-4′′), 6.92 (1H, d,= 3.6 Hz, H-4), 4.81 (2H, s, H-6)；13C-NMR (400 MHz, acetone6): 143.1 (C-5), 137.4 (C-2), 137.1 (C-2′′), 136.3 (C-5′), 136.1 (C-2′), 127.9 (C-4′′), 126.2 (C-4), 124.3 (C-3′), 124.3 (C-4′), 124.3 (C-5′′), 123.8 (C-3), 123.3 (C-3′′), 60.2 (C-6)。以上数据与文献报道基本一致[16]，故鉴定化合物9为α-三联噻吩甲醇。

化合物10：棕黄色粉末；ESI-MS293.4 [M＋H]+，确定相对分子质量为292；分子式为C14H12OS3；1H-NMR (400 MHz, acetone6): 7.46 (1H, dd,= 5.1, 1.0 Hz, H-5′′), 7.31 (1H, dd,= 0.8, 3.6 Hz, H-3), 7.23 (1H, d,= 3.8 Hz, H-4′), 7.20 (1H, d,= 3.8 Hz, H-3′), 7.17 (1H, d,= 3.6 Hz, H-3′′), 7.11 (1H, dd,= 5.0, 3.6 Hz, H-4′′), 7.01 (1H, d,= 3.6 Hz, H-4), 4.60 (2H, s, H-6), 3.35 (3H, s, H-7)；13C-NMR (100 MHz, acetone6): 144.2 (C-5′), 141.2 (C-5), 137.3 (C-2), 136.1 (C-2′′), 136.0 (C-2′), 128.1 (C-4′′), 127.2 (C-4), 125.0 (C-5′′), 124.5 (C-3′), 124.4 (C-4′), 124.0 (C-3), 123.3 (C-3′′), 68.5 (C-6), 56.9 (C-7)。以上数据与文献报道基本一致[19]，故鉴定化合物10为5-甲氧亚甲基-2,2′:5′,2′′-三联噻吩。

化合物11：棕黄色粉末；ESI-MS321.4 [M＋H]+，确定相对分子质量为320；分子式为C15H12O2S3；1H-NMR (400 MHz, acetone6): 7.47 (1H, dd,= 5.1, 1.0 Hz, H-5′′), 7.33 (1H, d,= 3.6, 1.0 Hz, H-3′′), 7.23 (1H, d,= 3.9 Hz, H-3′), 7.23 (1H, d,= 3.8 Hz, H-4′), 7.19 (1H, d,= 3.6 Hz, H-3), 7.13 (1H, d,= 3.7 Hz, H-4), 7.12 (1H, dd,= 5.1, 3.6 Hz, H-4′′), 5.25 (2H, s, H-6), 2.06 (3H, s, H-8)；13C-NMR (100 MHz, acetone6): 170.1 (C-7), 138.0 (C-5), 137.3 (C-2), 136.5 (C-5′), 136.3 (C-2′), 136.2 (C-2′′), 129.3 (C-4), 128.2 (C-4′′), 125.1 (C-5′′), 124.8 (C-3′), 124.6 (C-4′), 124.1 (C-3′′), 123.4 (C-3), 60.0 (C-6), 19.9 (C-8)。以上数据与文献报道基本一致[18]，故鉴定化合物11为5-羟甲基-(2,2′:5′,2′′)-三联噻吩乙酯。

化合物12：棕黄色粉末；ESI-MS363.1 [M＋H]+，确定相对分子质量为362；分子式为C18H18O2S3；1H-NMR (400 MHz, acetone6): 7.45 (1H, d,= 5.1 Hz, H-5′′), 7.32 (1H, d,= 3.6 Hz, H-3′′), 7.23 (1H, d,= 3.9 Hz, H-4′), 7.23 (1H, d,= 3.9 Hz, H-3′), 7.19 (1H, d,= 3.7 Hz, H-3), 7.13 (1H, d,= 3.7 Hz, H-4), 7.11 (1H, dd,= 5.1, 3.7 Hz, H-4′′), 5.29 (2H, s, H-6), 2.46 (1H, m, H-8), 1.71 (2H, m, H-9), 1.14 (2H, t,= 3.5 Hz, H-10), 0.88 (3H, d,= 4.4 Hz, H-11)；13C-NMR (100 MHz, acetone6): 175.5 (C-7), 138.3 (C-5), 136.5 (C-5′), 136.5 (C-2′′), 135.6 (C-2), 135.6 (C-2′), 129.1 (C-4), 128.2 (C-4′′), 124.8 (C-3′), 124.8 (C-5′′), 124.6 (C-4′), 124.1 (C-3′′), 123.3 (C-3), 59.9 (C-6), 40.6 (C-8), 26.5 (C-9), 16.0 (C-10), 10.9 (C-11)。以上数据与文献报道基本一致[20]，故鉴定化合物12为[2,2′:5′,2′′-三联噻吩]-5-基甲基-2-甲基丁酯。

化合物13：棕黄色粉末；ESI-MS361.5 [M＋H]+，确定相对分子质量为360；分子式为C18H16O2S3；1H-NMR (400 MHz, acetone6): 7.46 (1H, d,= 5.1 Hz, H-5′′), 7.32 (1H, d,= 3.6 Hz, H-3′′), 7.22 (1H, d,= 3.8 Hz, H-3′), 7.22 (1H, d,= 3.9 Hz, H-4′), 7.20 (1H, d,= 3.7 Hz, H-3), 7.16 (1H, d,= 3.7 Hz, H-4), 7.11 (1H, dd,= 5.0, 3.6 Hz, H-4′′), 6.19 (1H, qd,= 7.2, 1.4 Hz, H-4′′′), 5.36 (2H, s, H-1′′′), 1.98 (3H, dd,= 7.2, 1.5 Hz, H-5′′′), 1.89 (3H, s, H-6′′′)；13C-NMR (100 MHz, acetone6): 166.9 (C-2′′′), 138.2 (C-5), 138.1 (C-4′′′), 137.7 (C-2′), 136.5 (C-2′′), 136.3 (C-2), 135.6 (C-5′), 129.1 (C-4), 128.2 (C-4′′), 127.4 (C-3′′′), 125.1 (C-5′′), 124.7 (C-4′), 124.6 (C-3′), 124.1 (C-3′′), 123.4 (C-3), 59.9 (C-1′′′), 19.8 (C-6′′′), 15.1 (C-5′′′)。以上数据与文献报道基本一致[20]，故鉴定化合物13为5-羟甲基- (2,2′:5′,2′′)-噻吩当归酸酯。

化合物14：棕黄色粉末；ESI-MS361.5 [M＋H]+，确定相对分子质量为360；分子式为C18H16O2S3；1H-NMR (400 MHz, acetone6): 7.45 (1H, dd,= 5.1, 0.9 Hz, H-5′′), 7.31 (1H, dd,= 3.6, 0.8 Hz, H-3′′), 7.22 (1H, d,= 3.8 Hz, H-3′), 7.22 (1H, d,= 3.8 Hz, H-4′), 7.19 (1H, d,= 3.6 Hz, H-3), 7.14 (1H, d,= 3.6 Hz, H-4), 7.11 (1H, dd,= 5.0, 3.6 Hz, H-4′′), 6.91 (1H, qd,= 7.0, 1.3 Hz, H-4′′′), 5.33 (2H, s, H-1′′′), 1.83 (3H, t,= 1.0 Hz, H-6′′′) 1.81 (3H, dd,= 7.0, 0.9 Hz, H-5′′′)；13C-NMR (100 MHz, acetone6): 166.8 (C-2′′′), 138.3 (C-5), 137.7 (C-2′), 137.7 (C-4′′′), 136.5 (C-2′′), 136.3 (C-2), 135.6 (C-5′), 129.1 (C-4), 128.2 (C-3′′′), 128.1 (C-4′′), 124.7 (C-4′), 124.7 (C-5′′), 124.6 (C-3′), 124.0 (C-3′′), 123.4 (C-3), 60.2 (C-1′′′), 13.5 (C-5′′′), 11.3 (C-6′′′)。以上数据与文献报道基本一致[21]，故鉴定化合物14为5-羟甲基-(2,2′:5′,2′′)-噻吩巴豆酸酯。

化合物15：棕黄色粉末；ESI-MS329.1 [M＋H]+，确定相对分子质量为328；分子式为C18H16O2S2；1H-NMR (400 MHz, acetone6): 7.22 (1H, d,= 3.6 Hz, H-3), 7.22 (1H, d,= 3.9 Hz, H-3′), 7.22 (1H, d,= 3.9 Hz, H-4′), 7.15 (1H, d,= 3.6 Hz, H-4), 6.90 (1H, dd,= 7.0, 1.4 Hz, H-4′′′), 6.17 (1H, dd,= 17.5, 11.3 Hz, H-3′′), 5.77 (1H, dd,= 17.5, 1.9 Hz, H-4′′a), 5.65 (1H, dd,= 11.3, 1.9 Hz, H-4′′b), 5.34 (2H, s, H-1′′′), 1.80 (3H, dd,= 7.0, 1.0 Hz, H-5′′′), 1.83 (3H, t, H-6′′′)；13C-NMR (400 MHz, acetone6): 166.7 (C-2′′′), 139.1 (C-5), 137.7 (C-4′′′), 133.4 (C-5′), 133.3 (C-2′), 129.1 (C-4), 128.2 (C-3′′′), 127.1 (C-4′′), 124.5 (C-4′), 124.4 (C-3′), 124.1 (C-3), 122.1 (C-2), 116.7 (C-3′′), 93.0 (C-2′′), 82.1 (C-1′′), 60.1 (C-1′′′), 13.5 (C-5′′′), 11.2 (C-6′′′)。以上数据与文献报道基本一致[22]，故鉴定化合物15为 ()-[2,2′-联噻吩]-5-甲醇-5′-(3-丁烯-1-炔基)-2-巴豆酸酯。

化合物16：棕黄色粉末；ESI-MS329.1 [M＋H]+，确定相对分子质量为328；分子式为C18H16O2S2；1H-NMR (400 MHz, acetone6): 7.23 (1H, d,= 3.1 Hz, H-3), 7.22 (1H, d,= 3.8 Hz, H-3′), 7.22 (1H, d,= 3.9 Hz, H-4′), 7.17 (1H, d,= 3.6 Hz, H-4), 6.17 (1H, dd,= 17.5, 11.3 Hz, H-3′′), 6.13 (1H, dd,= 7.4, 1.4 Hz, H-4′′′), 5.77 (1H, dd,= 17.5, 1.9 Hz, H-4′′a), 5.65 (1H, dd,= 11.3, 1.9 Hz, H-4′′b), 5.36 (2H, s, H-1′′′), 1.98 (3H, dd,= 7.2, 1.5 Hz, H-5′′′), 1.88 (3H, m, H-6′′′)；13C-NMR (100 MHz, acetone6): 166.8 (C-2′′′), 138.2 (C-5), 138.1 (C-4′′′), 133.4 (C-5′), 133.3 (C-2′), 129.2 (C-4), 127.4 (C-3′′′), 127.1 (C-4′′), 124.1 (C-3), 124.1 (C-3′), 124.0 (C-4′), 121.6 (C-2), 116.7 (C-3′′), 93.0 (C-2′′), 82.5 (C-1′′), 59.8 (C-1′′′), 19.8 (C-6′′′), 15.0 (C-5′′′)。以上数据与文献报道基本一致[23]，故鉴定化合物16为 ()-5′-(3-丁烯-1-炔基)-[2,2′-噻吩]-5-甲醇-2-甲基巴豆酸酯。

化合物17：棕黄色粉末；ESI-MS289.3 [M＋H]+，确定相对分子质量为288；分子式为C15H12O2S2；1H-NMR (400 MHz, acetone6): 7.22 (1H, d,= 3.9 Hz, H-3′), 7.22 (1H, d,= 3.8 Hz, H-4′), 7.21 (1H, d,= 3.6 Hz, H-4), 7.13 (1H, d,= 3.6 Hz, H-3), 6.17 (1H, dd,= 17.6, 11.3 Hz, H-3′′), 5.76 (1H, dd,= 17.5, 2.0 Hz, H-4′′a), 5.65 (1H, dd,= 11.3, 2.0 Hz, H-4′′b), 5.25 (2H, s, H-6), 2.05 (3H, s, H-8)；13C-NMR (400 MHz, acetone6): 170.0 (C-7), 138.8 (C-5), 133.6 (C-5′), 133.3 (C-2′), 129.3 (C-4), 127.1 (C-4′′), 124.1 (C-3), 124.1 (C-3′), 124.0 (C-4′), 121.6 (C-2), 116.7 (C-3′′), 92.9 (C-2′′), 82.7 (C-1′′), 59.9 (C-6), 19.8 (C-8)。以上数据与文献报道基本一致[24]，故鉴定化合物17为5′-(3-丁烯-1-炔-1-基)-[2,2′-联噻吩]-5-甲醇-5-乙酯。

化合物18：棕黄色粉末；ESI-MS247.1 [M＋H]+，确定相对分子质量为246；分子式为C13H10OS2；1H-NMR (400 MHz, acetone6): 7.21 (1H, d,= 3.8 Hz, H-3), 7.17 (1H, d,= 3.9 Hz, H-3′), 7.17 (1H, d,= 3.9 Hz, H-4′), 6.94 (1H, d,= 3.7 Hz, H-4), 6.16 (1H, dd,= 17.6, 11.3 Hz, H-3′′), 5.84 (1H, dd,= 11.3, 2.0 Hz, H-4′′a), 5.76 (1H, dd,= 17.6, 2.0 Hz, H-4′′b), 4.78 (2H, s, H-6)；13C-NMR (100 MHz, acetone6): 147.1 (C-5), 146.9 (C-5′), 139.2 (C-2′), 135.7 (C-2), 133.3 (C-3), 127.0 (C-4′′), 125.0 (C-4), 124.1 (C-3′), 123.4 (C-4′), 116.7 (C-3′′), 92.8 (C-2′′), 82.5 (C-1′′), 59.0 (C-6)。以上数据与文献报道基本一致[25]，故鉴定化合物18为5′-羟甲基- 5-(3-丁烯-1-炔基)-2,2′-联噻吩。

3.2 抗T3SS活性筛选结果

通过SDS-PAGE检测沙门菌毒力蛋白分泌情况，筛选化合物1～18的抗T3SS毒力蛋白分泌活性，发现化合物5对毒力蛋白（SipA、B、C、D）的分泌表现出明显的抑制作用，化合物1、3、4表现出一定的抑制作用。浓度梯度实验结果表明（图1），化合物5对毒力蛋白分泌的抑制作用呈浓度相关性。在100 μmol/L时，显著抑制毒力蛋白的分泌；25 μmol/L时，对毒力蛋白的分泌仍有一定的抑制，且不影响鞭毛蛋白FliC的分泌。因此，化合物5可作为T3SS的抑制剂继续研究。

A-化合物1～9的活性筛选 B-化合物10～18的活性筛选 C-化合物5的结构 D-化合物5浓度相关性地抑制毒力蛋白Sip A、B、C、D的分泌；FliC-沙门菌鞭毛蛋白；M-Marker

4 讨论

应用多种色谱分离方法和核磁、质谱等技术从醴肠全草提取物中分离鉴定了18个单体化合物的结构，化合物6、15、16为首次从该植物中分离得到；利用SDS-PAGE法对化合物1～18进行T3SS抑制活性筛选，发现化合物1、3～5具有抗沙门菌T3SS的活性，其中化合物5具有较强的抗T3SS活性。本研究结果丰富了醴肠中化学结构的多样性，并为抗毒力药物的开发提供活性先导了化合物，为药用植物的开发和利用提供了理论基础。

利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突。

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Chemical constituents from whole herbs ofand active components inhibit T3SS of

ZHANG Xiao-chun, LU Chun-hua

Institute of Natural Medicinal Chemistry, School of Pharmaceutical Sciences, Cheeloo College of Medicine, Shandong University,Jinan 250012, China

To investigate the chemical constituents and anti-T3SS activity from whole herbs of.The chemical constituents were systematically separated and purified by Sephadex LH-20, Silica gel, MPLC and HPLC column chromatography, and identified based on their MS and NMR data. The anti-T3SS activities of compounds 1—18 on Salmonella were detected by SDS-PAGE assay.Eighteen compounds were obtained from the extracts ofand identified as orobol (1), 3′--methyl orobol (2), wedelolactone (3), isodemethyl wedelolactone (4), luteolin (5), 5′-(4-hydroxy- 1-butyn-1-yl)[2,2′-bithiophene]-5-carboxaldehyde (6), α-terthienyl (7), α-formylterthienyl (8), α-terthienyl methanol (9), 5- (methoxymethyl)-2,2′:5′,2′′-terthiophene (10), 5-hydroxymethyl-(2,2′:5′,2′′)-terthienyl acetate (11), [2,2′:5′,2′′-terthiophen]-5-yl methyl 2-methylbutanoate (12), 5-hydroxymethyl-(2,2′:5′,2′′)-terthienyl angelate (13), 5-hydroxymethyl-(2,2′:5′,2′′)-terthienyl tiglate (14), ()-5′-(3-buten-1-ynyl)-[2,2′-bithiophene]-5-methanol-2-methylcrotonate (15), ()-5′-(3-buten-1-ynyl)-[2,2′-bithiophene]-5- methanol- 2-methylcrotonate (16), 5′-(3-buten-1-yn-1-yl)-[2,2′-bithiophene]-5-methanol-5-acetate (17), and 5′-hydroxymethyl-5-(3-buten-1-ynyl)- 2,2′-bithiophene (18), respectively.Compounds 6, 15 and 16 are isolated from this plant for the first time. Compound 5 has significant anti-T3SS activity against the effector protein secretion, meanwhile, compounds 1, 3 and 4 showed certain activity, which provide a theoretical basis for the folk use ofas purulent, hemostatic, heat dysentery, antibacterial and anti-infective drugs.

L.; anti-T3SS ofactivity; anti-virulence drugs; thiophene; flavone; 5′-(4-hydroxy-1- butyn-1-yl) [2,2′-bithiophene]-5-carboxaldehyde; ()-5′-(3-buten-1-ynyl)-[2,2′-bithiophene]-5-methanol-2-methylcrotonate; luteolin

R284.1

A

0253 - 2670(2022)16 - 4940 - 08

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.16.003

2022-02-02

国家自然科学基金面上项目（22177062）；教育部创新团队项目（IRT_17R68）

张晓春（1996—），女，在读博士生，药学专业。E-mail: 2267837415@qq.com

鲁春华（1975—），女，教授，天然药物化学专业。E-mail: ahua0966@sdu.edu.cn

[责任编辑 王文倩]