LINC复合体的结构、与细胞骨架的连接及其对细胞功能调控作用研究进展

赵汐冉，张舒，胡泽兵，郭显，石菲

空军军医大学航空航天生物动力学教研室 航空航天医学教育部重点实验室，西安 710032

细胞可以感知微环境中的力学信号，将其转换为生物化学信号或通过物理传递的方式传导到细胞内，进而调整自身的力学特性和基因表达以适应生存微环境的改变［1］。近年来，越来越多的研究［2-3］显示核骨架—细胞骨架连接物（LINC）复合体在细胞机械信号传导与功能调控过程中扮演重要角色。LINC 复合体是由定位于内核膜的SUN（Sad1、UNC-84）结构域蛋白和定位于外核膜的KASH（Klarsicht、ANC-1、Syne homology）结构域蛋白在核周间隙互作结合形成。在胞质中，KASH 结构域可与胞质骨架的肌动蛋白、微管和中间丝相连，在胞核中，SUN结构域与细胞核骨架的核纤层蛋白、核纤层蛋白结合蛋白及染色质相连，从而为核内外细胞骨架形成机械连接搭建起桥梁。研究［4-7］表明，机械信号可经由LINC复合体传入细胞核，通过影响细胞核的形态和迁移、染色质重构和DNA 损伤修复、特异性基因的转录与表达等，直接或间接地对多种细胞功能起调控作用。现就LINC复合体的结构、与细胞骨架的连接及其对细胞功能调控作用研究进展情况综述如下。

1 LINC复合体的组成及结构域间的相互作用

1.1 LINC 复合体的组成 核膜由两层脂质双分子层组成，包括外核膜和内核膜，内、外核膜之间存在着约50 nm 宽的核周间隙，两层核膜在核孔处融合。内核膜的下方是核纤层，是由A 型、B 型纤层蛋白组成的中间细丝网状结构，在保证核膜结构完整性以及为染色质和调节蛋白提供锚定位点方面发挥重要作用。定位在内核膜和外核膜上的蛋白质在核周间隙中互作结合，形成LINC 复合体，为细胞核骨架与细胞质骨架形成机械连接提供桥梁。LINC 复合体是从酵母到人类高度保守的跨膜蛋白复合体，其主要组成成分包括SUN 结构域蛋白和KASH 结构域蛋白［8-9］。

SUN 结构域蛋白定位于内核膜上，其C 端氨基酸序列与酵母Sad1 蛋白和线虫UNC-84 蛋白有34%的相似性，因此被命名为Sad1、UNC-84（SUN）结构域。SUN 结构域蛋白具有N 端跨膜区、C 端保守的SUN结构域及其上游的卷曲螺旋结构域。SUN结构域蛋白的种类随着生物复杂性的增加而增加，目前在哺乳动物中已发现5 种SUN 蛋白，SUN1 和SUN2广泛存在于哺乳动物的各类细胞中，而SUN3、SUN4、SUN5仅在精细胞中特异性表达［8，10］。

KASH 结构域蛋白定位于外核膜上，是尾部锚定的单次跨膜蛋白。由于其C端跨膜区的氨基酸序列与果蝇Klarsicht蛋白、线虫ANC-1蛋白、哺乳动物的Syne-1蛋白同源而得名，被称为Klarsicht、ANC-1、Syne Homology（KASH）结构域。KASH 结构域可以与SUN 结构域结合并发生相互作用，KASH 肽链C-端的PPPX 基序与SUN 结构域中的20个氨基酸环共同参与LINC 复合体的形成。目前，在人体已发现6 种KASH 蛋白，其中4 种为核膜血影重复蛋白（Nesprins）。Nesprins的基本结构包括C端跨膜区的KASH结构域、N端由串联成对的钙结合蛋白同源域组成的肌动蛋白结合域（ABD）以及两者之间多个血影蛋白重复序列（SR）形成的棒状区，不同亚型拥有的SR 个数不同。Nesprin1 与Nesprin2 高度同源，其SR 区集中于C 端并被螺旋结构的小分子序列隔开，具有良好的弹性。Nesprin1/2 均有大、小两类亚型：Nesprin1 的 大 亚 型 为Nesprin1G，Nesprin1 α 和Nesprin1 β 为 其 小 亚 型；Nesprin2 的 大 亚 型 是Nesprin2G，小 亚 型 为Nesprin2 α、Nesprin2 β、Nesprin2 γ。Nesprin3 在骨髓和脂肪组织中表达较高，具有Nesprin3α 和Nesprin3β 共2 个蛋白亚型，均不具备N 端的ABD 结构。Nesprin4在分泌性上皮细胞中表达，其结构更简单，仅包含1个SR和KASH结构域，无ABD。KASH 5 是一种减数分裂期参与同源染色体配对的生殖细胞特异性蛋白，结构也比较简单，包含1 个中央螺旋区和KASH 结构域。此外，淋巴限制膜蛋白（Jaw1/LRMP）是一种Ⅱ型整合膜蛋白，定位于内质网和外核膜，具有KASH 肽序列和拓扑结构，可在胞质—胞核间的机械力传递以及维持细胞核的定位与形态中发挥作用，因此Jaw1/LRMP被认为是KASH 结构域蛋白的新成员。KOZONO等［11］的研究显示，Jaw1可在核周间隙与SUN1、SUN2蛋白相互作用，并以低聚物的形式与胞质表面的微管结合，通过形成跨核膜LINC复合体起维持细胞核形态的作用。

1.2 LNIC 复合体结构域间的相互作用 LINC 复合体的主要功能是连接胞质骨架与细胞核骨架，约束定位细胞核，维持整个细胞的机械特性，SUN结构域蛋白和KASH 结构域蛋白之间强而稳定的相互作用是实现上述功能的基础［9］。研究［12］显示，对细胞实施低强度振动刺激时，Nesprins 和SUN 蛋白去耦联会抑制细胞的机械调节反应。MAYER 等［13］观察到LINC 复合体去耦联会导致小鼠胚胎成纤维细胞（NIH3T3）的核应变和变形明显降低，证实LINC 复合体功能丧失将影响细胞质骨架与细胞核骨架间的机械力传导。由于C 端卷曲螺旋的存在，SUN 结构域常折叠成β-夹心结构，延伸出1 个约20 个氨基酸残基的β-发卡，被称为KASH-lid。在该结构的N端，螺旋延伸与相邻的SUN 结构域形成三重卷曲螺旋，构成1 个“三叶草”形状的同源三聚体［14］。SUN-KASH 的结合互作在靠近外核膜的核周间隙中进行，与KASH 结合后SUN 结构域的氨基酸环构象发生改变，三聚体形式的SUN 结构域与外核膜的3 个KASH 肽相互作用形成复杂的异源六聚体［9］，KASH 肽分布于2 个相邻的SUN 结构域亚单位所形成的结合裂隙之中。所以，SUN 蛋白的三聚化是它与KASH结合的前提。

迄今为止，所有已经鉴定的KASH 多肽的1 个标志性特征就是严格定位于蛋白质的C 末端。研究者为进一步探究SUN-KASH 相互作用的细节，对KASH 肽残基用数字进行反向标记［9］，从C 端开始，最后1 个残基位置记为0，后面的依次为负数。残基0 位于SUN 原聚体1 表面的1 个疏水口袋中，与羧酸盐发生接触反应，使肽长度维持高度保守性。-1、-2、-3 位置的3 个脯氨酸均为反式构象，通过范德华力与SUN 紧密结合。位置在-4、-5、-6 的残基更多的暴露在溶剂中，它们的侧链与SUN 的相互作用不强。-7 位置的酪氨酸处在由SUN 原聚体1 和2 形成的狭隙中，高度保守。接下来的3 个KASH 残基夹在SUN 原聚体1 的KASH-lid 和SUN原聚体2 的核心之间，它们与KASH-lid 以氢键结合，形成一条β 短链。-9 处的亮氨酸也位于SUN 原聚体1 与2 之间的缝隙中，同样高度保守。-11 处的脯氨酸终止了β 链。在-11 和-12 之间，肽链发生约90°的扭结，以继续连接到-23 位置的N 端半胱氨酸上。扭结后的肽链仅与SUN 原聚体2 相互作用，除缩短了与-23 处半胱氨酸的距离外，最主要的作用是将-17 处的苯丙氨酸埋入疏水口袋中。-23 处的半胱氨酸与SUN-C563 以二硫键结合，SUN-C563 的保守性及活细胞中SUN-KASH 二硫键的存在进一步稳定了SUN 与KASH 的相互作用。另外，在SUN原聚体1 和KASH 之间形成了11 个氢键，原聚体2与KASH 之间有13 个，通过这24 个氢键将KASH 肽与SUN 三聚体牢固的连接在一起。另外，SUN 在N636 处 被 糖 基 化，N636 位 于SUN 表 面 但 不 与KASH 肽接触，说明N-糖基化对SUN-KASH 结合是非必要的。总的来说，每条KASH 肽都夹在2 个相邻的SUN 原聚体之间并与原聚体产生许多紧密互作，以保证SUN-KASH 强而稳定的结合关系。KASH 蛋白可以和一种或多种SUN 蛋白配对，因此LINC 复合体存在多种异构体。

2 LINC复合体与细胞骨架的连接

LINC 复合体可作为桥梁连接细胞质骨架与细胞核骨架，使机械力从胞质传导入胞核，在细胞机械信号传导中发挥重要作用。LINC 复合体借助KASH 结构域蛋白的N 端与细胞质骨架中的肌动蛋白、微管和中间丝相连接。细胞受到机械力刺激时，RhoA 信号被激活并在细胞内形成F-肌动蛋白应力纤维，Nesprins 可以与这些肌动蛋白纤维结合以调节细胞核的形态、方向和运动［15-16］。Nesprin1是最早发现的1 个核膜蛋白，与Nesprin2 同源度高，Nesprin1/2 可通过N 端保守的CH 域与细胞骨架肌动蛋白纤维连接。调节细胞形状的机械刺激可使与肌动蛋白帽相互作用的Nesprins 的数量增加［15］。相反，如果Nesprins 被消耗，肌动蛋白帽则无法形成，人间充质干细胞（hMSCs）无法通过增加核张力来响应基质硬化，导致成骨激活受影响，hMSCs 从成骨分化转向成脂分化［17］。还有研究［18］显示，虽然基质应变激活粘着斑信号的过程不需要Nesprins参与，但当干细胞中的Nesprin1 被耗尽时，基质应变诱导的Yes 相关蛋白（YAP）入核过程会受到抑制。这些结果表明，Nesprins 可通过多种方式与肌动蛋白相互作用，在细胞质骨架和细胞核间传递支撑力，由此介导整个细胞的动力传导。Nesprin3 的N 端缺乏CH 域，不能与肌动蛋白纤维直接结合，但可以与plectin 的actin 结合域相作用，进而与细胞质中的中间丝连接［19］。Nesprin4、KASH5 的N 端可分别招募并结合Kinesin-1 和Dynein，通过这种方式与胞质中的微管相互作用。KASH 结构域蛋白新成员Jaw1 也可以低聚物的形式与微管结合，不过具体机制还有待进一步研究［11］。此外，在细胞质中，肌动蛋白纤维还可以通过肌动蛋白交联因子7与微管相连，微管又通过pectin 与中间丝相连。由此，Nesprins 一方面通过N 端以直接或间接的方式与肌动蛋白、微管、中心丝相互作用，参与胞质细胞骨架网状连接的形成以及核膜外分子在外核膜上的锚定；另一方面，其C 端跨膜区的KASH 结构域可与SUN 结构域在核周间隙内结合，组装形成LINC 复合体。

LINC 复合体通过SUN 蛋白的N 端延伸到细胞核中，可以与核孔复合体（NPCs）蛋白、核纤层蛋白Lamins、核纤层结合蛋白Emerin 以及染色质结合。SUN1 与NPCs 的关联结合依赖于SUN1 核质结构域和腔内结构域的协同作用，SUN1 被干涉破坏后，NPCs 发生聚集，在核膜上的分布改变［20］。SUN1 N 端的核质结构域还可以优先结合新合成的A 型核纤层蛋白前体，为NPCs与A型核纤层蛋白相连接提供桥梁，也进一步介导了A型核纤层在NPCs中聚集组装。ELOSEGUI-ARTOLA 等［21］发现，生长在硬基质上的细胞会形成局灶性粘连和应力纤维，应力纤维通过与LINC 复合体耦联向胞核传递力，使胞核变扁、核孔拉伸，降低了核孔转运的机械阻力，促进YAP 入核。利用转染阻断Nesprins 与SUN 间的作用，使LINC 复合体功能受损，则会干扰细胞质与细胞核间的机械耦合，抑制YAP 及其辅助因子TAZ转位，细胞增殖也会受影响。UZER 等［22］观察到消耗或破坏SUN1/2 时，小鼠MSCs 细胞中β-连环蛋白与核骨架的相互作用受损，β-连环蛋白入核被抑制，核内表达水平下降。这说明LINC 复合体功能不良会降低机械信号（如低强度振动、基质应变等）激活β-连环蛋白的效率。此外，SUN 结构域蛋白N 端可与Emerin 结合［23］，通过Emerin 与胞核内的肌动蛋白连接，在胞质细胞骨架—核内肌动蛋白—染色质之间建立物理连接，进而影响染色质的移动和转录。

由此可见，LINC 复合体通过将胞质内的细胞骨架肌动蛋白、微管、中间丝同核内的核纤层、核纤层结合蛋白、核孔复合体、染色质连接起来，在胞质与胞核之间建立物理连接，确保细胞感受到的机械信号可以从胞质传导入胞核，引发细胞核结构和功能改变的同时，影响基因的激活与表达，使细胞对机械力做出完整应答。

3 LINC复合体对细胞功能的调控作用

LINC 复合体以自身结构为基础在核膜上搭建连接桥，使环境中的机械刺激可以持续地从细胞质传递到细胞核，将机械信号转变为生物化学信号，直接或间接地调控细胞结构与功能。LINC 复合体在调节核形态和迁移、减数分裂与DNA 损伤修复、基因的转录与表达中发挥重要作用。

3.1 调节核形态和迁移 LINC 复合体的结构和组成是其调控细胞核形态与迁移的生物学基础。Nesprins 决定核周肌动蛋白及中间丝的结构和分布，可对整体细胞形状和力学响应产生影响。在NIH3T3 细胞中分析Nesprin2G 的受力情况发现，其受力与肌动球蛋白收缩和细胞伸长有关，且机械张力主要作用在胞核顶端和赤道面，这也为LINC复合体通过感知肌球蛋白依赖性张力来改变胞核形状提供了佐证［24］。GUILLUY等［25］用磁性镊子对Nesprin1施加力会触发核硬化，这一过程不涉及染色质或核肌动蛋白，但需要核纤层以及位于内核膜上的Emerin。机械力刺激Nesprin1 可诱发Emerin 的Tyr磷酸化，改变其与Lamin 的结合，从而导致细胞核硬化。Nesprin1 被沉默时，HUVEC 细胞无法对周期应变作出响应而重新定向，胞核高度、粘着斑数量明显增加，但细胞迁移速率降低［26］。此外，Nesprin1 敲低会使细胞核结合肌动蛋白丝的张力降低［27］。LINC复合体可以耦合细胞核和微管，促进神经发生及神经元迁移。对迁移细胞的Nesprin2G、SUN2 进行抑制，细胞核移动、中心体重新定向会明显受阻［5］。此外，在NIH3T3 细胞为迁移而进行中心体定向时，Nesprin2G与SUN2可以组成一种新型核膜蛋白线性阵列，被称为跨膜肌动蛋白相关核（TAN）线［28］，TAN线能将细胞核与移动的肌动蛋白束耦合，使胞核定位在细胞后方，中心体定位在细胞核与细胞前缘之间。

3.2 调控减数分裂和DNA 损伤修复 LINC 复合体通过与相关肌动蛋白连接，可以影响减数分裂期染色体功能，调控基因组结构，并在染色体重组过程中发挥重要作用。减数分裂Ⅰ期的染色体配对过程依赖于同源染色体间的物理交叉，在此期间DNA 双链断裂（DSB）、同源染色体配对联会、同源重组以实现高保真的DSB 修复。减数分裂Ⅰ期开始时，核膜上LINC 复合体与端粒结合将染色体连接到细胞骨架［29］，减数分裂特异性蛋白KASH 5与dynein相互作用介导端粒定位，随后端粒引导染色体运动使染色体在细胞骨架力的推动下聚集在靠近中心体的细胞核极点，最终形成减数分裂花束。在DNA 损伤反应过程中也有LINC 复合体参与［30］，SUN1/2受损时，会导致细胞DNA 损伤过度、基因组不稳定性增加、DNA 修复受损。人SUN1 蛋白及其同源物UNC-84可与Ku 70/Ku 80 和DNA 依赖性蛋白激酶DNA-PK相互作用，抑制非同源末端连接（NHEJ）并促进RAD 51到达DSB位点，进行同源重组修复［31］。研究者认为，LINC 复合体在DNA 修复中发挥保守作用，主要是通过抑制NHEJ 和促进染色体断裂位点的同源重组来实现的。此外，还有研究［32］显示在酵母和哺乳动物细胞中，DSB 位点周围染色质的流动性增加，这与DNA 损伤反应因子53BP1、SUN1/2、LINC复合体和动态微管的调控有关。

3.3 调控基因的转录与表达 LINC 复合体传递机械刺激调控基因转录与表达的方式主要有以下三种：第一，机械刺激通过LINC 复合体的物理连接将力传递到基因组。研究［33］显示，机械力通过肌动球蛋白和LINC复合体传导到染色质，通过核纤层—染色质相互作用诱导染色质拉伸并上调转录，且施力方向和应力幅度也会影响染色质流动性和基因表达。第二，LINC 复合体介导的机械力传递引起核膜成分或生化信号改变。在上皮祖细胞中，LINC 复合体传导机械力引起的核膜变化可以抵消持续拉伸引起的转录上调［34］。在持续拉伸过程中，内核膜上的Emerin 重新定位到外核膜并与非肌肉肌球蛋白ⅡA作用促进细胞质肌动蛋白聚合，导致核肌动蛋白水平降低，由于核G-肌动蛋白可以与RNA 聚合酶Ⅱ结合以增强转录，所以核肌动蛋白水平降低会使细胞转录受抑制［35］。对RhoA/SRF/Mkl1 信号通路，SUN蛋白可通过向RhoA 发出信号来调节Mkl1 的激活，但SUN1 与SUN2 在此过程中的作用并不一致。第三，LINC 复合体通过调控microRNA 的合成调节基因表达。研究［6］发现，SUN1 主要亚型的核质结构域可以充当辅助因子启动特定细胞类型中microRNA的生物发生。

综上所述，细胞对机械刺激的反应与应答是一个复杂的多层次过程，细胞感受机械信号并将其从细胞质传递到细胞核，通过引起自身结构和功能改变以适应生存环境的变化。LINC 复合体是机械信号从细胞质骨架传递到细胞核骨架的桥梁，它可以通过多种途径直接或间接地调控细胞结构与功能，在细胞生物力学响应中发挥重要作用。近期研究提示，模拟微重力对细胞胞核形状、基因转录与表达的影响可能与LINC复合体的调控有关。一直以来，在空间生物学研究领域，细胞对重力变化如何感知、如何响应始终备受关注，针对该问题，以跨核膜LINC复合体为切入点，围绕它在胞质—胞核机械信号传导中的作用和具体机制继续深入探究，有可能获得更多新发现，也有望为开展失重生物学效应及防护措施研究提供新思路。