阿美替尼对结肠癌细胞增殖、迁移侵袭及凋亡的抑制作用*

张耀帅，郭 宇，范云蕾，张语涵，范方田，李 娴，李姗姗，刘 浩

蚌埠医学院药学院，安徽省生化药物工程技术研究中心，蚌埠 233030

结肠癌是常见的消化道恶性肿瘤，发病率和死亡率逐年升高，最新癌症统计报告显示，结肠癌的发病率升至第3位，死亡率在第2位[1]。目前，结肠癌的治疗手段以手术切除为主，但其复发率较高。化疗是结肠癌常见的联合治疗手段，手术联合化疗可显著抑制结肠癌的发生发展，但由于化疗药物缺乏靶向性，因此常伴有严重的毒副反应[2]，且长期用药后容易产生耐药，导致化疗联合治疗效果不佳[3]。分子靶向治疗是针对恶性肿瘤细胞关键调控分子而设计的一种治疗方式，相较于传统的化疗药物，靶向药物可以结合特异性靶点，使肿瘤细胞死亡，但不会对周围正常细胞产生影响，因此近年来越来越受到临床医生的重视。

表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor，EGFR)是一种跨膜糖蛋白，与表皮生长因子结合能够启动核内相关基因表达，促进细胞增殖，在肿瘤发生发展过程中扮演着重要的角色。表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂(EGFR-TKI)能够阻断EGFR与其配体结合，抑制肿瘤细胞的生长[4]。研究表明，EGFR-TKI可对多种癌症发挥抗肿瘤作用，如肺癌[5]、乳腺癌[6]、结肠癌[7]。阿美替尼(Almonertinib)是具有自主知识产权的小分子EGFR-TKI，可靶向EGFR而发挥抗肿瘤作用[8]。临床前研究表明阿美替尼对肺癌有较好的治疗效果，但对于结肠癌细胞的作用尚未见相关文献报道。本研究以SW620和HT29细胞作为研究对象，旨在探索阿美替尼对结肠癌细胞增殖、凋亡、侵袭、迁移以及对荷瘤小鼠肿瘤生长的影响，探讨其可能的作用机制，为结肠癌的临床治疗方案提供更多选择，为阿美替尼应用于临床治疗结肠癌提供理论和实验依据。

1 材料与方法

1.1 主要实验材料

细胞株：结肠癌SW620细胞、结肠癌HT29细胞购自武汉普诺赛生命科技有限公司。实验动物：SPF级BALB/c裸鼠购自常州卡文斯实验动物有限公司，许可证号：SCXK(苏)2016-0010。试剂：阿美替尼(江苏豪森药业有限公司)、E-cadherin抗体(Proteintech，批号：20874-1-AP)、Vimentin抗体(Proteintech，批号：10366-1-AP)、Bax抗体(Proteintech，批号：50599-2-Ig)、Bcl-2抗体(Proteintech，批号：12789-1-AP)、β-actin抗体(Proteintech，批号：20536-1-AP)、DMEM培养液(Gibco，批号：8121130)、McCoy 5A培养液(上海中乔新舟生物科技有限公司，批号：ZQ-1000)、胎牛血清(ExCell Bio，批号：FSP500)、CCK-8试剂(APE BIO，批号：K101816133EF5E)、胰酶消化液(Biosharp，批号：BL501A)、青霉素-链霉素溶液(Biosharp，批号：BL505A)、RIPA裂解液(碧云天生物，批号：P0013C)，Annexin Ⅴ-FITC/PI试剂盒(贝博生物，批号：BB21051)、Transwell小室(Corning公司，批号：3422)、BCA蛋白浓度测定试剂盒(Biosharp，批号：BL521A)。

1.2 细胞培养

SW620细胞培养于含有10%胎牛血清和1%青霉素-链霉素的DMEM培养液中，HT29细胞培养于含有10%胎牛血清和1%青霉素-链霉素的McCoy 5A培养液中，置于37℃、5% CO2、饱和湿度的恒温培养箱中。

1.3 CCK-8法检测细胞存活率

消化处理SW620、HT29细胞，牛鲍计数板计数，使细胞悬液浓度为5×104个/mL，充分混悬后接种于96孔板中，每孔加100 μL细胞悬液，放于37℃、5% CO2培养箱中培养。待细胞密度达到60%～80%时，吸除培养液，加入含有不同浓度阿美替尼(0、1、2、4、8、16、32 μmol/L)的培养液，每组设置6个复孔，分别孵育24、48 h后，每孔加入10 μL的CCK-8溶液(避光)，37 ℃培养箱中孵育40 min，用酶标仪在450 nm处测定吸光度(A)值，细胞存活率=(对照组A值-实验组A值)/对照组A值×100%。

1.4 流式细胞仪检测细胞凋亡

将SW620和HT29细胞接种于6孔板中，每孔2×105个细胞，完全培养液培养，待细胞密度达到60%～80%左右时，吸去孔内培养液，每孔加入含有不同浓度阿美替尼(0、1、2、4 μmol/L)的培养液2 mL，置于37℃、5% CO2培养箱中培养24 h。收集细胞于10 mL EP管中，1500 r/min离心10 min，弃上清，每管加入200 μL Annexin Ⅴ结合液重悬细胞，每管加3 μL Annexin Ⅴ-FITC，冰上孵育15 min，每管加入5 μL PI染色液，避光混匀、冰上孵育10 min。每管再加入200 μL AnnexinⅤ结合液，混匀后用纱布过滤，加入流式管中，样品在1 h内用流式细胞仪检测。

1.5 Transwell侵袭及迁移实验

基质胶与无血清培养液按照1∶8比例稀释，在Transwell小室上室内加入60 μL基质胶，置于37℃恒温培养箱中40 min，待基质胶凝固。消化处理SW620和HT29细胞，分别使用无血清DMEM培养液和McCoy 5A培养液调整为含有不同浓度阿美替尼(0、1、2、4 μmol/L)的2×105/mL细胞悬液。取100 μL细胞悬液加入上室，下室加入700 μL含10%胎牛血清的培养液，每组设置2个复孔，实验重复3次；培养24 h后取出小室，用PBS轻轻冲洗，用4%多聚甲醛室温固定15 min，用结晶紫染液室温染色20 min。光学倒置显微镜下计数侵袭至微孔膜下层的细胞，每个样本选取3个视野，取平均值。迁移实验无铺基质胶步骤，其余步骤同侵袭实验。

1.6 蛋白印迹(Western blot)实验检测蛋白表达

将SW620和HT29细胞接种于100 mm大皿中，当细胞密度达到60%～80%时，加入含有不同浓度阿美替尼(0、1、2、4 μmol/L)的培养液处理，给药24 h后刮取蛋白，BCA蛋白浓度试剂盒测定蛋白浓度。根据公式计算加入上样缓冲液和裂解液量，充分混匀，使终浓度相同，蛋白在95℃条件下加热5 min。40 μg蛋白上样电泳(上层胶电泳70 V 30 min，下层胶电泳120 V 90 min)，半干转法转至PVDF膜上(恒压24 V 30 min)，快速封闭液封闭20 min。根据目标蛋白分子量剪切PVDF膜，孵育相应一抗，4℃孵育过夜。次日用TPBS室温清洗3次，放入对应二抗中，室温孵育1.5 h，曝光机显影曝光，采用Image J软件分析条带灰度值。

1.7 动物实验

基质胶与PBS按照1∶2比例稀释，将SW620细胞离心收集，置于配好的稀释液中充分重悬混匀，将细胞注射到5周龄左右裸鼠右前肢皮下，建立裸鼠模型。待皮下瘤生长至100 mm3，随机分为3组(每组6只)，分别给予二甲基亚砜、5-氟尿嘧啶20 mg/kg腹腔注射及阿美替尼10 mg/kg灌胃，1次/2 d。每次给药前记录裸鼠体重、肿瘤体积大小(肿瘤体积为长×宽2/2)、死亡裸鼠编号，治疗结束后取裸鼠心、肝、脾、肺、肾组织，将获取的标本脱水，石蜡包埋，厚1 μm切片，行苏木精-伊红(HE)染色。所有动物研究均经蚌埠医学院实验动物教学与研究委员会批准([2021]第160号)。

1.8 统计学方法

2 结果

2.1 阿美替尼抑制SW620、HT29细胞增殖

SW620、HT29细胞给予不同浓度阿美替尼(0、1、2、4、8、16、32 μmol/L)培养24 h和48 h后，每孔加入10 μL CCK-8溶液，结果表明随阿美替尼浓度和培养时间的增加，SW620和HT29细胞存活率逐渐下降(图1)。

与对照组比较，*P<0.05 **P<0.01图1 阿美替尼抑制SW620和HT29细胞增殖Fig.1 Almonertinib inhibited the proliferation of SW620 and HT29 cells

2.2 阿美替尼诱导SW620、HT29细胞凋亡

SW620、HT29细胞给予不同浓度阿美替尼(0、1、2、4 μmol/L)培养24 h后，流式细胞仪上机检测凋亡。结果显示，与对照组相比，随着阿美替尼给药浓度增加，SW620和HT29细胞凋亡率显著增加，具有剂量依赖性(图2A)。采用Western blot实验对凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2进行检测，与对照组相比，不同浓度阿美替尼(1、2、4 μmol/L)处理组SW620和HT29细胞中Bax蛋白表达显著升高、Bcl-2蛋白表达显著降低(图2B)。

A：不同浓度阿美替尼处理SW620和HT29细胞24 h，用Annexin Ⅴ-FITC / PI检测凋亡细胞，比较不同浓度组的细胞凋亡率；B：通过Western blot检测Bax和Bcl-2蛋白表达；与对照组(0 μmol/L Almonertinib)比较，*P<0.05 **P<0.01图2 阿美替尼诱导SW620和HT29细胞凋亡Fig.2 Almonertinib induced apoptosis of SW620 and HT29 cells

2.3 阿美替尼抑制SW620、HT29细胞侵袭、迁移

SW620、HT29细胞给予不同浓度阿美替尼(0、1、2、4 μmol/L)培养24 h，观察细胞侵袭和迁移数目，与对照组相比，给予阿美替尼(1、2、4 μmol/L)组细胞的侵袭和迁移数目显著减少。采用Western blot实验对侵袭迁移相关蛋白E-Cadherin、Vimentin进行检测，与对照组相比，不同浓度阿美替尼(1、2、4 μmol/L)处理组SW620和HT29细胞中E-Cadherin蛋白表达显著升高、Vimentin蛋白表达显著降低(图3)。

A：不同浓度阿美替尼处理SW620细胞24 h，检测SW620细胞的侵袭和迁移染色，通过Western blot检测E-cadherin和Vimentin的表达；B：不同浓度阿美替尼处理HT29细胞24 h，检测HT29细胞的侵袭和迁移染色，通过Western blot检测E-cadherin和Vimentin的表达；与对照组比较，**P<0.01图3 阿美替尼抑制SW620和HT29细胞侵袭和迁移Fig.3 Almonertinib inhibited invasion and migration of SW620 and HT29 cells

2.4 阿美替尼体内抗肿瘤作用

为了评价阿美替尼对结肠癌细胞体内生长的作用，本研究将SW620细胞移植到BALB/c裸鼠右前肢皮下制备裸鼠荷瘤模型。与对照组相比，阿美替尼抑制肿瘤生长(图4A、4B)，减缓裸鼠体重的降低(图4C)，延长荷瘤裸鼠生存时间(图4D)，采用HE染色对心、肝、脾、肺、肾组织进行染色，观察阿美替尼对荷瘤小鼠的损伤作用，结果表明阿美替尼治疗没有造成明显的脏器损伤(图4E)。

A：阿美替尼抑制裸鼠皮下瘤生长；B：裸鼠肿瘤体积；C：裸鼠体重；D：裸鼠生存曲线；E：裸鼠心脏、肝脏、脾脏、肺和肾脏的苏木精-伊红染色切片(×400)图4 阿美替尼体内抗肿瘤作用Fig.4 Anti-tumor effect of Almonertinib in vivo

3 讨论

结肠癌是一种常见的消化道恶性肿瘤，多数患者在被诊断出患病时已经发生转移[9-10]，即使通过手术治疗也容易复发。化疗药物虽然具有明显的抗肿瘤作用，但由于缺乏靶向性，在杀伤肿瘤细胞的同时，也可引起严重的不良反应[11]。靶向药物治疗具有疗效好、副作用小等特点，在结肠癌的治疗中具有一定的优势。第3代EGFR-TKI奥西替尼可通过诱导结肠癌细胞发生自噬发挥抗肿瘤作用，奥西替尼通过刺激凋亡显著抑制结直肠癌细胞生长，且奥西替尼诱导的结肠癌细胞凋亡与其靶向EGFR T790M的活性无关[7]。阿美替尼是在奥西替尼的基础上通过结构修饰获得的第3代酪氨酸激酶抑制剂，阿美替尼对肺癌有较好的治疗效果，但关于阿美替尼对结肠癌细胞作用的研究尚未见相关报道。本实验从体内外研究阿美替尼对结肠癌细胞SW620和HT29的作用，发现阿美替尼可以抑制SW620和HT29细胞增殖，诱导SW620、HT29细胞凋亡，促进Bax蛋白表达、降低Bcl-2蛋白表达，同时Transwell侵袭迁移实验结果表明阿美替尼可抑制SW620、HT29细胞侵袭迁移，促进E-Cadherin蛋白表达、降低Vimentin蛋白表达。荷瘤裸鼠体内实验结果表明阿美替尼可以抑制肿瘤发展、延缓裸鼠体重的降低、延长裸鼠生存时间，且对荷瘤小鼠的心、肝、脾、肺、肾等组织没有明显损伤。

肿瘤细胞侵袭和迁移是肿瘤恶化的主要原因，肿瘤复发和转移是影响结肠癌患者预后及导致患者死亡的主要因素。Transwell实验结果表明阿美替尼可以抑制SW620和HT29细胞的侵袭、迁移能力。上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transformation，EMT)是一种可逆的细胞过程，其在细胞生长过程中具有重要作用，EMT与细胞的侵袭、迁移及肿瘤发生发展有关[12]。已有文献报道称EMT可以促进结肠癌细胞的侵袭迁移[13]。上皮细胞标志物E-cadherin蛋白、间质细胞标志物Vimentin蛋白可以反映上皮表型的丧失和间充质细胞的再生，研究表明在EMT过程中观察到E-cadherin蛋白表达降低，Vimentin蛋白表达增加[14]。本研究Western blot实验结果表明，给予阿美替尼后，SW620和HT29细胞E-cadherin蛋白表达上调，Vimentin蛋白表达下调。这些结果表明阿美替尼可以抑制结肠癌SW620和HT29细胞侵袭、迁移及EMT。

本课题组前期研究发现阿美替尼可以抑制非小细胞肺癌PC9、H1975细胞[5]和乳腺癌MDA-MB-231细胞[6]的增殖，诱导细胞凋亡。阿美替尼抑制PC9和H1975细胞增殖、侵袭、迁移的机制可能是抑制肿瘤细胞EMT过程和金属蛋白酶的表达；阿美替尼通过抑制EGFR/PI3K/Akt信号通路，抑制TNBC MDA-MB-231细胞的增殖，诱导细胞自噬和凋亡。

综上所述，阿美替尼作为第3代新型靶向治疗药物，可抑制SW620和HT29细胞增殖、侵袭、迁移，诱导细胞凋亡，作用机制可能与抑制肿瘤细胞EMT有关。本研究为结肠癌临床治疗提供了新的思路和策略，为扩大阿美替尼临床应用提供了实验和理论依据。