青岛冬春季大气气溶胶中抗生素抗性基因组成及影响因子❋

贾世杰， 王 娇，2， 王 钦， 刘晓环，2， 祁建华，2， 高会旺，2❋❋

(1.中国海洋大学环境科学与工程学院， 山东 青岛 266100； 2.中国海洋大学海洋环境与生态教育部重点实验室， 山东 青岛 266100)

广泛存在于气溶胶中的病原微生物很大程度上存在着抗生素耐药性甚至多药耐药问题，威胁着人类健康[1-2]。世界卫生组织已经将抗生素耐药问题定义为全球性公共卫生危机[3]。这种抗生素耐药性问题是由存在于微生物细胞内的抗生素抗性基因(ARGs)导致的。这些ARGs可以在不同微生物间水平转移，在微生物群落间广泛传播，甚至还会导致泛耐药细菌(即“超级细菌”)的产生。存在于各类环境介质中的ARGs作为一种威胁人类健康的新兴污染物，引发了公众的广泛关注。气溶胶作为人类直接接触的环境，其中的ARGs及其宿主微生物将会通过呼吸作用直接进入人体，影响疾病的治疗。

气溶胶中ARGs的组成受多种因素的影响。霾天等重污染天气下高浓度的颗粒物会给ARGs及其宿主菌提供更多的附着位点[4]。养殖场和医院等场所的大气中通常有着较高的ARGs丰度，这与局地抗生素的大量使用有关[5-6]，随后这些ARGs会随着气流而运输迁移到其他区域。气溶胶中的微生物群落往往存在明显的季节性变化[7]，ARGs也不例外。Xie等[8]发现，北京城市和乡村冬季气溶胶中ermB、tetW和qnrS的丰度明显高于其他季节。风速、相对湿度和温度是影响气溶胶中细菌群落的主要气象因子[9]，而颗粒物粒径、浓度和化学组分则是影响气溶胶中细菌群落的主要理化因子[10-11]，这些影响在细菌季节性差异上显得尤为明显[12-13]。Ouyang等[14]发现，在雨天ARGs与Cl-、Ca2+、Na+、K+离子和湿度有着较强的相关性。气象因子和理化因子同样也可能影响着ARGs的季节性分布，但这些影响尚未明确。

已有研究表明，气溶胶中ARGs的组成具有一定的地区差异[15]。青岛作为一个典型的沿海城市，气溶胶中ARGs整体上受海陆双重作用的影响，其东、南濒临黄海，既会受到海风对污染物的稀释，又会受到沿海水产养殖排放的影响；西、北方向是内陆地区，会受到内陆远距离传输的影响。因此，分析青岛气溶胶中ARGs组成及季节差异，探究其影响因子，有助于更全面的认识沿海地区生物气溶胶的组成，对理解气溶胶中ARGs的来源及其传输机制具有重要的意义。因此，本文于2019—2020年在青岛地区采集了冬季和春季大气气溶胶样品，对其中的5类12种ARGs、1种可移动遗传原件(MGEs)、16S rRNA和化学组分进行了分析，探究了冬春两季青岛气溶胶中ARGs的组成差异及气象因子和大气污染物对其影响。

1 材料与方法

1.1 样品采集

采样地点位于青岛市中国海洋大学崂山校区大气环境观测场内(36°09′N，120°29′E)，该采样点位于青岛市东南部，设置在山包上，为局部的最高点，不受建筑物阻挡，气流交换通畅，无养殖场、医院等ARGs局地污染源，受人为干扰较弱，因此具有区域代表性。采用2031型大流量总悬浮颗粒物(TSP)采样器(青岛崂应环境科技有限公司)和Whatman石英滤膜，于2019年12月—2020年5月采集TSP样品36个(其中冬季样品13个，春季样品23个)，每个样品以1.05 m3/min流量采集约24 h。采样前将采样膜于450 ℃灼烧5 h，并用75%酒精擦拭采样器、滤料架和镊子进行灭菌，采样后将样品立刻保存在-20 ℃冰箱内，直至DNA提取。

1.2 样品处理与分析

于超净台内裁取1/4张样品膜，加入50 mL PBS缓冲液，4 ℃下300g离心3 h，经0.2 μm PES膜过滤，采用PowerSoil土壤DNA提取试剂盒和AMPure XP磁珠提取过滤得到颗粒物中的DNA[16]。采用NanoPhotometer检测DNA的纯度及浓度后，将合格样品保存于-20 ℃冷冻保存。

采用博日PCR仪对选定的5类12种ARGs，1类MGEs和16S rRNA基因进行定性检测，基因名称、引物序列和退火温度如表1所示[14,17-22]。将PCR产物克隆到PMD19-T质粒中，并通过DH5α大肠杆菌扩大培养，提取其中的质粒作为qPCR阳性对照，建立标准曲线。采用ABI 7500 qPCR仪进行qPCR定量检测，总反应系统包括10 μL Fast Start Universal SYBR Green Master(Rox)，0.6 μL Primer-F(10 mmol/L)，0.6 μLPrimer-R(10 mmol/L)，1 μL DNA，0.2 μL BSA和7.5 μL ddH2O。

表1 目的基因的引物信息

1.3 气象数据和大气污染物数据来源

通过观测场内的自动气象站实时获取采样期间的温度、相对湿度、风向和风速等数据。每小时的AQI、PM10、PM2.5、CO、NO2、SO2以及O3浓度数据来源于青岛市环境保护局网站(hbj.qingdao.gov.cn/slairhour.aspx)，具体监测站点为崂山区子站(36°09′N，120°46′E)。

1.4 数据统计与分析方法

本研究采用SPSS19.0分析不同ARGs亚型间的spearman相关性，以p<0.05作为差异显著水平；采用RStudio进行冬春季气溶胶中ARGs的主坐标分析(PCoA)；采用Canoco 4.5进行基于冬春季气溶胶中ARGs组成和环境因子的冗余分析(RDA)。

2 结果与讨论

2.1 冬季和春季气溶胶中抗生素抗性基因的组成

青岛2019年冬季气溶胶中TSP的浓度为(156.43±82.90) μg/m3，2020年春季为(111.35±38.81) μg/m3，与春季相比，冬季气溶胶中TSP的浓度更高。ARGs丰度分析结果显示(见图1)，气溶胶中ARGs的组成存在明显的季节性差异，bla-TEM1、tetW、tetL、sul1、sul3、ermC、ermB在冬季有更高的丰度；bla-CMY2、tetA在春季有更高的丰度，strB在两个季节差异不明显，而bla-NDM1和sul2整体丰度较低，只在个别样品中有检出(见图1(a))。青岛气溶胶中ARGs的主导亚型也存在季节差异，冬季气溶胶中bla-TEM1((1.42×105±1.64×105) copies/m3)丰度最高，其次是tetL((3.41×104±1.38×104) copies/m3)和sul1((2.12×104±2.57×104) copies/m3)；春季气溶胶中tetL((1.78×104±1.29×104) copies/m3)丰度最高，其次是bla-CMY2((1.66×104±4.42×104) copies/m3)和strB((1.61×104±1.26×104) copies/m3)。整体而言，冬季β-内酰胺类ARGs占比(55.47%)>四环素类ARGs(21.38%)>磺胺类ARGs(8.95%)>大环内酯类ARGs(8.73%)>氨基糖苷类ARGs(5.20%)；春季四环素类ARGs占比(35.93%)>β-内酰胺类ARGs(29.44%)>氨基糖苷类ARGs(17.30%)>大环内酯类ARGs(10.14%)>磺胺类ARGs(7.19%)。β-内酰胺类和四环素类抗性基因是环境中常见的ARGs。在洛杉矶和北京的大气环境中，bla-TEM1基因也都占据着主导地位[25]。随着季节的变化，青岛地区气溶胶中的ARGs由β-内酰胺类抗性基因主导逐渐转变为四环素类抗性基因主导。

图1 冬季和春季气溶胶中不同ARGs亚型、intI1、16S rRNA及总ARGs绝对丰度及各ARGs亚型/16S rRNA相对丰度

PCoA分析结果见图2。其中主成分1的解释度为39.5%，主成分2的解释度为22.04%。春季和冬季气溶胶样品各自聚类，有较好的分离度，表明这两个季节的ARGs组成存在较大差异，进一步证实了先前的观点。整体而言，青岛地区气溶胶中ARGs的组成存在较强的季节性变化。

图2 冬季和春季基于气溶胶中ARGs亚型的PCoA分析

值得注意的是，尽管冬季ARGs的污染较重，但intI1和16S rRNA均在春季有着更高的丰度，春季16S rRNA的平均丰度是冬季的20倍(见图1(a))。Qi等[7]的研究表明，在青岛地区，春季气溶胶中的细菌数量最高，冬季和夏季最低。这意味着春季气溶胶中有着更高的细菌数量，但其中具有抗生素耐药性的细菌数量远少于冬天。ARGs/16S rRNA的相对丰度也证实了这一点，尽管一些ARGs在春季丰度更高，但ARGs相对于16SrRNA的丰度均在冬季更高(见图1(b))。

冬季气溶胶中ARGs的总丰度((2.77×105±2.20×105) copies/m3)明显高于春季((9.28×104±9.76×104) copies/m3)，青岛冬季气溶胶中有着更强的ARGs污染。与此相同，北京地区和土耳其博卢地区气溶胶中ARGs的丰度均在冬季有最高值(见表2)。冬季气溶胶中ARGs的高丰度可以归因于较高的颗粒物浓度和冬季抗生素用药量的增加。一方面，一些游离在细胞外的ARGs也能够吸附在颗粒物上，随气溶胶的传播向远处扩散[26-27]，青岛地区气溶胶中ARGs的总丰度与颗粒物浓度呈显著相关(r=0.404，p<0.05)。Zhang等[17]对于北京地区气溶胶中ARGs的研究也表明，随着颗粒物浓度的增高，ARGs丰度逐渐增加。另一方面，冬季大量的抗生素使用诱导了ARGs的产生。郭倩等[28]的研究证实，温带地区温度较低的冬季流感发病率增加。陈岷等[29]的研究表明，冬季抗菌药物的使用量高于春季，且冬季β-内酰胺类药物的使用量最高。整体而言，冬春季青岛地区气溶胶中ARGs的丰度高于北京地区、珠江流域和长江流域同种ARGs的丰度，但低于珠江口春夏季同种ARGs的丰度。因此，不应忽视青岛地区气溶胶中ARGs污染及其对人体健康的危害。

表2 本研究与其他研究中不同季节ARGs丰度

2.2 不同月份气溶胶中抗生素抗性基因的组成

青岛地区气溶胶中各ARGs存在一定的月变化趋势(见图3)。12和1月各ARGs中bla-TEM1占主导，3和5月tetL占主导，而4月则是bla-CMY2占主导。从2019年12月—2020年5月，tetW，tetL和sul3的丰度逐渐下降；bla-TEM1、bla-CMY2、bla-NDM1、sul1、sul2、ermB和strB的丰度在12—3月明显下降，但在4月有所增加，在5月再次下降，低于3月平均丰度；tetA的丰度变化存在波动，在1月有最高值，在4月出现次高值；ermC的丰度则在1月有最高值，12月有次高值，在3—5月明显下降。整体而言，除bla-CMY2和strB外的全部ARGs均在冬季出现丰度最大值，bla-CMY2和strB在春季出现丰度最大值。对于总ARGs和intI1而言，其丰度变化趋势与大部分ARGs相同，在12—3月明显下降，在4月有所升高，在5月继续下降。总ARGs丰度最大值出现在12月((3.34×105±2.38×105) copies/m3)，这意味着尽管4月存在较强的ARGs污染，但就整体而言，青岛地区冬季气溶胶中ARGs的污染更重。采样期间TSP浓度为：12月((161.17±104.78) μg/m3)>1月((150.89±57.01) μg/m3)>4月((118.56±42.62) μg/m3)>3月((108.86±24.81) μg/m3)>5月((91.65±44.71) μg/m3)，这一趋势与许多ARGs丰度变化趋势相近。这些ARGs丰度的变化更大程度上受颗粒物浓度的影响，而对于其他ARGs，如tetW、tetL和sul3等，它们的丰度变化受季节性影响更强，更多存在于冬季气溶胶中，这与抗生素的季节性使用和这些ARGs及其宿主菌对环境因子的响应有关。16S rRNA的丰度在12—5月期间呈明显递增趋势，在5月有最高丰度((2.45×107±2.27×107) copies/m3)，随着月份的变化，气温逐渐升高，整体细菌丰度也随之增高。

图3 不同月份气溶胶中不同ARGs亚型、intI1、16S rRNA及总ARGs丰度

2.3 气溶胶中抗生素抗性基因间的相关性

为了探究青岛地区不同ARGs间的共性，分析不同ARGs在来源和传输过程上的潜在共性，对ARGs进行了spearman相关性分析，分析结果见图4。大部分ARGs间存在显著正相关关系，其丰度变化趋势相近，如在12和1月等高颗粒物负荷的情况下，大部分ARGs丰度均增加。tetW、tetL和sul3与其他ARGs间存在相对较弱的正相关关系或无显著相关性，sul3甚至与一些ARGs存在显著负相关关系，但这三者之间存在显著的正相关关系，再次证明了图3的结果。这三者与其他ARGs不同，受药物使用等季节性因素的影响大于颗粒物浓度的影响。除此之外，strB与其他ARGs间的正相关性也相对较弱，仅与5种ARGs存在显著正相关，这意味着strB可能有着与其他ARGs不同的来源或传输过程。与此相反，ermB与其他ARGs间的正相关性相对较强，它与除bla-NDM1和sul2以外的9种ARGs间均存在显著的正相关性(r=0.36～0.81，p<0.05)。在所有ARGs中，bla-NDM1和sul2间存在着最强的正相关关系(r=0.98，p<0.01)，这意味着这两种ARGs具有一定的共耐药机制。研究表明，当一些基因位于同一质粒上时，它们通常会出现在同一环境中，而一些存在共现性的ARGs很可能位于相同的质粒上，进而表现出共耐药机制[31-32]。

(:0.01

2.4 环境因子与气溶胶中抗生素抗性基因间的关系

温度、湿度、风速和风向等气象因子会对气溶胶中的颗粒物浓度和细菌丰度产生直接影响[33-34]，同时也会对ARGs产生影响。因此，对冬季和春季气溶胶中ARGs的组成和气象因子进行了RDA分析(见图5)。气象因子对青岛地区不同季节气溶胶中ARGs的组成有着较强的影响。在冬季，风速和温度是影响气溶胶中ARGs组成最重要的因素。温度与sul1、ermB、bla-TEM1、tetW和intI1呈正相关，这些ARGs在低温天存在更低的丰度，这意味着低温天青岛地区气溶胶中病原菌对相应抗生素的耐药性更弱，给人类健康带来的潜在风险更低(见图5(a))。风速与bla-CMY2、sul3、strB、sul1和ermB呈正相关。风向与sul1、ermB、bla-TEM1、tetW和intI1正相关。这些与风向、风速相关的ARGs可能来自于较远的区域，随着风传输到了研究区域。湿度与bla-CMY2、sul3、strB、sul1、ermB、bla-TEM1和intI1呈正相关，这些ARGs在冬季高湿度天对人类健康的潜在风险更高。与冬季相比，春季气溶胶中ARGs的分布受到温度和湿度的影响更强，全部ARGs都与湿度呈明显的负相关关系，春季湿度高的天气下ARGs对人类健康的潜在风险更低(见图5(b))。除此之外，温度对ARGs也存在较强的影响，但仅intI1，bla-NDM1，sul2和bla-CMY2与温度呈正相关关系，温度的升高对大部分ARGs及其宿主菌存在不利影响，也降低了这些ARGs的潜在人类健康风险。春季风向与intI1、bla-NDM1、sul2、bla-CMY2和tetA正相关，风速与所有ARGs间均存在负相关，这些与风速、风向相关的ARGs可能有额外的来源。

青岛地处北温带季风区，且受附近的海洋环境调节，冬季主要受西北风影响，夏季主要受东南风影响。冬季采样期间青岛地区北风频率较高(27.56%)，其次是西北偏北风(16.67%)和东北偏北风(15.71%)。其中，北风(3.78 m/s)和东北偏北风向(3.21 m/s)的平均风速也相对较高，整体受北风的影响较强(见图5(c))。青岛地区北方是陆地区域，由于工业生产和人类生活的排放，污染相对于东南方向的海洋更为严重，北风带来的颗粒物和ARGs的污染均较强。冬季气溶胶中strB，tetW，sul3和intI1与风向呈正相关(见图5(a))，这些ARGs很可能来源于北方陆地区域。而春季采样期间青岛地区东南风频率较高(20.83%)，其次是东北偏北风(11.41%)和北风(10.14%)，这三个方向的平均风速也相对较高，均超过了3.25 m/s，其中东北偏北风速最高，为4.11 m/s(见图5(d))。青岛地区东南方向是南黄海，海风与陆地风相比更为清洁，可以稀释陆地气溶胶中的一些人为源污染物。而春季丰度相对较高的bla-CMY2和tetA则可能是由于采样地点东南部陆地区域的排放或附近养殖区的逸散而来。并且，春季气溶胶中bla-NDM1，sul2，bla-CMY2和tetA与风向呈正相关(见图5(b))，进一步证明了这些ARGs可能来源于采样点东南部的青岛地区生产生活排放和近岸养殖区的排放。此外，对于MGEs，intI1在春季的丰度高于冬季(见图1)，这意味着春季气溶胶中ARGs的水平转移潜力更强。

((a)冬季RDA，(b)春季RDA，(c)冬季风频和风速，(d)春季风频和风速。(a)Winter RDA, (b)Spring RDA，(c)Wind frequency and speed in winter，(d)Wind frequency and speed in spring.)

青岛地区冬季和春季气溶胶中ARGs亚型和大气污染物间的关系具有明显的差异(见图6)。冬季气溶胶中ermB、sul3、tetW、sul1、intI1和bla-TEM1与颗粒物浓度间存在正相关关系，这些颗粒物可以给ARGs及其宿主菌提供附着位点(见图6(a))。但颗粒物浓度显然不是影响bla-NDM1、ermC、sul2、tetA和strB的主要影响因素，这些ARGs在冬季呈现出的高丰度可能是由于冬季大量用药导致的ARGs的额外产生和扩散。气溶胶中不同粒径的颗粒物对微生物和ARGs有着不同的富集能力[35]。PM2.5～10对ARGs组成的影响大于PM2.5。除此之外，除O3外的大部分其他污染物与颗粒物有着相似的影响，在高污染情况下，ARGs有更高的潜在人类健康风险。大部分ARGs与AQI间存在正相关关系，但这种关系相对较弱，ARGs在一定程度上会受到空气污染的影响，但在冬季，这种影响弱于其他污染物。

春季大气污染物对ARGs的影响与冬季呈现明显的不同，全部ARGs和intI1均与PM2.5、PM2.5～10、PM10和AQI间呈正相关关系，大部分ARGs与颗粒物间呈强正相关关系，随着颗粒物浓度的增加，ARGs丰度均明显上升(见图6(b))。颗粒物为细菌等微生物和ARGs提供了附着位点，是影响ARGs丰度的重要因素。不同ARGs与不同粒径颗粒物间的相关关系存在明显差异，tetL、tetW、ermC和sul3与PM2.5～10相关性更强，而intI1、sul2、bla-NDM1、bla-CMY2和tetA与PM2.5相关性更强。整体而言，与冬季相同，PM2.5～10对气溶胶中ARGs的组成影响更大。而与冬季不同的是，春季气溶胶中O3与大部分ARGs间呈更强的负相关关系，在采样期间，春季O3浓度((113.04±22.66) μg/m3)远大于冬季((34.46±17.82) μg/m3)，随着O3浓度的增加，对ARGs的富集逐渐开始产生不利影响。春季气溶胶中SO2、CO和NO2等气态污染物与颗粒物依旧有着相似的作用，它们与全部ARGs间均存在正相关关系，这意味着在高污染天，ARGs和气态污染物对人类健康存在着协同影响，会进一步增强对人类健康的危害。AQI与全部ARGs呈正相关，且这种相关性要比冬天更强，春季空气污染对ARGs对的影响强于冬季。

图6 冬季和春季基于气溶胶中ARGs亚型和大气污染物的RDA分析

Gong等[36]的研究发现，青岛地区总微生物浓度在4.7～7.0 μm和大于7.0 μm时，粒径分布较高。与微生物的分布趋势相同，无论是冬季还是春季，青岛地区ARGs分布受PM2.5～10的粗颗粒影响强于PM2.5。不同ARGs及其宿主菌倾向于附着在不同粒径的颗粒物上，对比冬春两季发现，tetW、ermC、sul3及其宿主菌倾向于吸附在PM2.5～10上，而intI1则与PM2.5有着更强的相关性；其余ARGs在不同季节有着不同的倾向性。

图7 冬季和春季基于气溶胶中ARGs亚型和化学组分的RDA分析

3 结语

青岛地区冬季污染程度较高，ARGs总丰度和大部分ARGs亚型的丰度均高于春季。冬季和春季气溶胶中ARGs组成差异明显，冬季β-内酰胺类抗性基因尤其是bla-TEM1占主导地位，春季四环素类抗性基因尤其是tetL占主导地位。不同ARGs在冬春两季对温度和湿度的响应不同，春季湿度对全部ARGs呈抑制作用。ARGs丰度受颗粒物浓度的影响，颗粒物负荷较高的情况下将会存在更高的ARGs污染风险，PM2.5～10比PM2.5对ARGs有更强的富集作用，这一点在春季尤为明显。青岛作为沿海城市，地处海岸区域，冬季青岛地区气溶胶中ARGs主要受北方内陆地区长距离输送影响，春季则受东南部陆地和近海气团影响较大。不同ARGs亚型存在不同的潜在来源，整体而言，青岛地区气溶胶中大部分ARGs受土壤扬尘影响较大，其他人为源和河水/海水等水体的散逸同样可能是一些ARGs的来源。但这些不同来源对青岛地区气溶胶中ARGs的贡献仍需进一步探究。