丛枝菌根真菌对镉胁迫下黑麦草光合生理的响应

韩 玮

（广安职业技术学院，四川 广安 638000）

大气颗粒物沉降、有毒有害污染物的乱排乱放、化工产业污水灌溉、农用化学杀虫除草剂的违法使用等问题导致土壤重金属污染现象愈加突出，对农作物质量、动物和人体健康以及城市生态环境造成危害［1-2］。其中重金属镉（Cd）因其具有危害性大、易富集、难降解等特性，被人们广泛关注［3-4］。研究发现，Cd污染不仅会引起土壤理化性质、养分保持功能的下降失调，还会较大程度地影响植物光合作用、气体交换、养分吸收等生理活动，导致植物生长受阻，干物质积累能力下降，新陈代谢活动受到显著抑制［5-7］。有试验表明Cd胁迫下匍匐翦股颖（Agrostis stolonifera）初期生长受到抑制，叶绿素含量下降，丙二醛（MDA）含量不断上升，抑制作用随Cd浓度的增加而增强；Cd浓度为200 mg·L-1条件下，叶绿素和MDA含量分别是对照的37%和864%；植株叶片中超氧化物歧化酶（SOD）和过氧化物酶（POD）活性随Cd浓度增加呈现先升后降的趋势［8］。唐星林等［9］发现Cd胁迫下龙葵（Solanum nigrum）叶片净光合速率（Pn）、气孔导度（Gs）、胞间CO2浓度（Ci）以及PS II最大光化学效率（Fv/Fm）均不同程度小于对照处理，单株、地上部和根系生物量与对照相比分别减小了47%、33%和49%，证实Cd胁迫处理下因非气孔因素限制了龙葵光合作用。基于上述研究，增强植物对重金属的抗性、修复城市土壤系统，是目前亟须解决的问题。

生物修复技术在修复重金属污染土壤中的潜在作用是近年来研究的热点问题。其中丛枝菌根（AM）真菌是一种土壤有益微生物，能够与大多数高等植物建立互惠共生关系，广泛存在于各种重金属污染的土壤中［10-11］。AM真菌有助于寄主植物从土壤中获取养分和矿质元素，缓解土壤中存在的各种非生物（盐害、高温、干旱等）胁迫，分解有毒物质、修复重金属污染土壤等［12］。研究发现接种AM真菌（Glomus intraradice）BEG141能提高Cd污染处理下玉米（Zea mays）的株高、生物量、光合色素含量、光合特性和抗氧化酶活性，降低Ci和叶片MDA含量，减轻Cd胁迫的效应并促进植物生长［13］。温室盆栽试验下，添加Cd的处理对菌根侵染率无影响且显著改善花生（Arachis hypogaea）生长发育状况，显著提高植株体内磷含量与吸收速率；与不接种对照（NM）相比，叶片叶绿素相对含量增加12%；同一污染水平下，接种处理植株的Fv/Fm和PSⅡ潜在活性（Fv/Fo）均显著高于NM处理，Pn、蒸腾速率（Tr）和Gs均显著增大，而Ci显著降低，证实了AM真菌可通过提高花生对磷的吸收来增加光合作用，增强抗Cd毒害的能力，以促进植株生长［14］。赖娟等［15］也发现Cd污染条件下美洲黑杨（Populus deltoides）接种根内根孢囊霉（Rhizophagus intraradices）后脯氨酸含量显著增加，渗透调节能力进一步加强，并恢复固碳能力和激素平衡。

黑麦草（Lolium perenne）属于禾本科黑麦草属植物，在我国栽培范围较广且经济效益强，品种近20种。因其生长迅速、分蘖能力强、易成坪、茎叶柔嫩光滑、耐踩踏、品质好，被广泛用于我国南北方的牧草和城市草坪草。相关研究发现，AM真菌在一定程度上能够缓解Cd污染对黑麦草株高、根长和生物量积累的抑制作用，显著提高叶片叶绿素含量［16］。但重金属Cd胁迫下菌根真菌对黑麦草光合生理、Cd吸收以及生态耐受性等方面的影响则少见报道。因此，本研究以黑麦草为对象，探究Cd污染条件下接种不同AM真菌对植株光合参数、叶绿素荧光、生理活性、养分吸收、生长变化以及Cd的吸附作用，从而认识AM真菌对重金属胁迫的缓解效应，为今后修复重金属Cd污染的研究提供一定的科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试材料为多年生黑麦草，供试AM真菌菌种为摩西斗管囊霉（Funneliformis mosseae，FM）、变形球囊霉（Glomus versiforme，GV）。AM真菌的接种物来源于中国AM真菌种质资源库，接种物为孢子、侵染根段、外生菌丝和培养基质的混合物。供试土壤为壤土，经高压灭菌（温度121 ℃，压力0.12 MPa）后备用。将黑麦草种子用4%NaClO溶液消毒，然后再用无菌水反复冲洗晾干，在光照培养箱中催芽，选择大小一致、饱满成熟的黑麦草种子进行播种。试验容器采用聚乙烯盆钵，规格为25 cm×20 cm，每盆装3 kg土壤，试验土壤均风干后过1 mm筛。土壤pH 6.94，电导率130 μS·cm-1，有效磷56.3 mg·kg-1，碱解氮79.5 mg·kg-1，有机质2.1%。

1.2 试验方法

采用室内盆栽试验，分别设Cd污染浓度为0、5、15、30 mg·kg-1，接种AM真菌FM、GV、混合处理（FM+GV）以及不接种处理（NM），共16个处理，随机排列，每个处理3次重复。具体操作为称取灭菌土壤并测量含水率，根据换算公式得到土壤干重，以确定添加Cd的量。不同浓度Cd处理以CdCl2溶液的形式添加到土壤中，得到0、5、15、30 mg·kg-1Cd浓度水平污染土，分别记为Cd0、Cd5、Cd15和Cd30。对 于FM、GV以 及FM+GV处理组，每盆土接种AM真菌菌剂30 g（50个孢子/g），并混至均匀；对照NM处理组，则接种灭菌的菌剂30 g，以保持相同的微生物环境。每盆播种50粒黑麦草种子，土壤水分保持在田间持水量的60%～70%，植物生长期间保持正常水分供应。试验在自然光照保温室中进行，昼、夜间温度和湿度分别为29、20 ℃和60%、75%。黑麦草培养65 d后开始测量各项指标。

1.3 指标测定

生长指标测定：地表到植株最高点作为株高。植物在烘箱中杀青10 min后烘至恒重并称重。

菌根侵染率的测定：采集黑麦草根系，用乳酸甘油染色法进行计算菌根侵染率［17］。公式如下：菌根侵染率=Σ（0×根段数+10%×根段数+ 20%×根段数+…+100%×根段数）/总根段数。

光合指标的测定：Pn、Tr、Gs、Ci参数采用CIRAS-2便携式光合测定系统（美国）测定。

生理指标的测定：SOD活性采用邻苯三酚自氧化法测定，POD活性采用愈创木酚氧化法测定，可溶性蛋白含量采用考马斯亮蓝G-250法测定，MDA含量采用硫代巴比妥酸（TBA）法测定。

叶绿素和N含量的测定：采用手持式叶绿素测定仪（TYS-B）测定叶绿素含量；植物体N含量采用硫酸-过氧化氢消煮、碱化后蒸馏定氮的方法测定。

叶绿素荧光的测定：采用FMS-2荧光仪进行测定。测量前进行暗适应，并用锡箔纸包裹待测叶片。得到暗适应参数后，计算得出Fv/Fo值、Fv/Fm值。

重金属Cd含量的测定：采用原子吸收-石墨炉法测定植物地上部和根系的Cd含量。

1.4 数据处理

采用Excel 2007对数据进行处理和绘图，采用DPS 7.5和SPSS 11.5对数据进行单因素方差分析、双因素方差分析以及差异显著性检验（LSD法，α=0.05）。图表中数据为平均值±标准误。

2 结果与分析

2.1 Cd胁迫下AM真菌对黑麦草生长和菌根侵染率的影响

同一Cd浓度下，接种FM、GV以及FM+ GV处理均显著增加了黑麦草株高和生物量。随Cd浓度的增加，黑麦草的株高和生物量显著下降。Cd浓度为30 mg·kg-1时，与NM相比，FM处理的黑麦草株高和地上干重分别提高14.6%和6.6%，GV处理下分别提高8.8%和6.9%，FM+GV处理下分别提高34.1%和18.8%。不同Cd浓度下，接种AM真菌各处理均对黑麦草根系存在侵染情况。随Cd浓度的增加，AM真菌侵染率呈现下降的趋势。Cd浓度为0 mg·kg-1时，接种FM+GV处理的黑麦草根系侵染率最高，为62.7%；Cd浓度为30 mg·kg-1时，FM处理侵染率下降为38.3%，GV处理为33.0%，FM+GV处理为42.7%（表1）。说明Cd处理下AM真菌与黑麦草建立了良好的共生关系，FM+GV处理侵染效果更好（图1）。可知，在不同Cd浓度处理下，接种AM真菌处理均可增加黑麦草的株高和生物量，其中FM+GV处理接种效果优于FM、GV处理。双因素方差分析表明，Cd胁迫、不同接种处理及其交互作用对黑麦草株高和干重有显著影响，其中Cd浓度对黑麦草株高的影响较大（表2）。

2.2 Cd胁迫下AM真菌对黑麦草叶绿素和N含量的影响

同 一Cd浓 度 下，FM、GV以 及FM+ GV处理均显著增加了黑麦草叶片叶绿素和N元素的含量，不同接种间表现为FM+GV＞FM＞GV＞NM，且差异显著（P＜0.05）。同一接种处理下，随Cd浓度的增加，叶绿素含量和地上部N含量、根系N含量呈现下降的趋势。Cd浓度为30 mg·kg-1时，与NM相比，FM处理的黑麦草叶绿素含量、地上部N含量和根系N含量分别提高8.4%、45.6%和41.2%，GV处理下分别提高6.5%、32.4%和29.4%，FM+GV处 理 分 别 提 高26.2%、70.6%和85.3%（表3）。由此可知，FM+GV处理对叶绿素含量、植物地上部和根系N含量的增加优于FM、GV处理，表明接种AM真菌均能不同程度促进Cd胁迫下黑麦草叶绿素的合成，提高植株对N元素的吸收。双因素方差分析表明，Cd胁迫、不同接种处理及其交互作用对黑麦草叶绿素含量和地上部、根系N含量有显著影响，其中Cd浓度对根系N含量的影响较大（表2）。

表1 Cd处理下黑麦草生长情况和AM真菌侵染状况

图1 丛枝菌根真菌侵染黑麦草情况

表2 Cd胁迫下黑麦草各指标双因素方差分析

表3 Cd处理下黑麦草叶绿素和N含量

2.3 Cd胁迫下AM真菌对黑麦草叶绿素荧光参数的影响

同一Cd浓度下，FM、GV以及FM+ GV处理均增加了黑麦草叶片PSⅡ最大光化学效率（Fv/Fm）和PSⅡ潜在活性（Fv/Fo）。随Cd处理浓度的增加（0～30 mg·kg-1），Fv/Fm值和Fv/Fo值呈现下降的趋势。Cd浓度为30 mg·kg-1时，与NM相比，FM处理的黑麦草Fv/Fm值和Fv/Fo值分别提高5.4%和11.5%，GV处理分别提高1.4%和10.5%，FM+GV处理分别提高4.9%和19.7%（图2）。由上述结果可知，在不同Cd浓度下，接种AM真菌各处理均能不同程度提高Fv/Fo值，对Fv/Fm值的提升效果较小。双因素方差分析表明，Cd胁迫、不同接种处理对黑麦草Fv/Fm值、Fv/Fo值有显著影响，其交互作用对Fv/Fm值有显著影响、对Fv/Fo值影响不显著（表2）。

图2 Cd胁迫下黑麦草PSⅡ最大光化学效率和潜在活性

2.4 Cd胁迫下AM真菌对黑麦草光合参数的影响

同一Cd浓度下，FM、GV以及FM+GV处理均增加了黑麦草叶片Pn、Tr和Gs，而降低了Ci。同一接种处理下，随Cd浓度的增加，Pn、Tr和Gs均呈现下降的趋势，而Ci则上升。在Cd浓度30 mg·kg-1下，与NM相比，FM处理的黑麦草叶片Pn、Tr和Gs分别增加15.6%、11.7%和7.5%，Ci下降5.2%；GV处理的黑麦草叶片Tr和Gs有所下降，Pn增加12.5%，Ci下降3.9%；FM+GV处理的黑麦草叶片Pn、Tr和Gs分别增加19.8%、28.3%和14.7%，Ci下降6.5%（图3）。双因素方差分析表明，Cd胁迫、不同接种处理对黑麦草Tr、Pn、Gs、Ci影响显著，其交互作用对Tr影响显著、对Pn、Gs和Ci影响不显著（表2）。

2.5 Cd胁迫下AM真菌对黑麦草生理变化的影响

同一Cd浓度下，FM、GV以及FM+ GV处理显著增加了黑麦草叶片SOD、POD活性和可溶性蛋白含量，而降低了MDA含量。同一接种处理下，随Cd浓度的增加，SOD活性和可溶性蛋白含量均呈现下降的趋势，而POD活性和MDA含量则上升。在Cd浓度为30 mg·kg-1时，与NM相比，FM处理的黑麦草叶片SOD、POD活性和可溶性蛋白含量分别增加19.6%、36.5%和17.7%，MDA含量下降41.4%；GV处理的SOD、POD活性和可溶性蛋白含量分别增加16.3%、32.0%和33.9%，MDA含量下降28.7%；FM+GV处理的SOD、POD活性和可溶性蛋白含量分别增加29.3%、50.2%和82.3%，MDA含量下降50.0%（表4）。双因素方差分析表明，Cd胁迫、不同接种处理及其交互作用对黑麦草SOD、POD活性和可溶性蛋白、MDA含量影响显著，其中Cd浓度对可溶性蛋白含量影响较大（表2）。

2.6 AM真菌对黑麦草Cd吸收的影响

同一Cd浓度下，FM、GV以及FM+ GV处理显著增加了黑麦草根系对Cd的吸收，减少Cd向地上部的运输。根系Cd含量为FM+GV＞FM＞GV＞NM。随Cd浓度的增加，黑麦草地上部和根系Cd含量均显著升高，其中，黑麦草根系Cd含量显著高于地上部。在Cd浓度为30 mg·kg-1时，FM+GV处理的根系Cd含量最高，达606.7 mg·kg-1，地上部Cd含量也较高，达到88.1 mg·kg-1（表5）。双因素方差分析表明，Cd胁迫、不同接种处理及其交互作用对黑麦草地上部与根系Cd含量的影响显著，其中对根系Cd含量影响较大（表2）。

表4 不同处理下黑麦草生理变化

表5 不同处理下黑麦草地上部分和根系Cd含量 （mg·kg-1）

3 讨论

3.1 AM真菌处理对植物Cd吸收的影响

AM真菌修复作为一种高效、无污染的重金属修复技术，其吸附、固持重金属，修复污染土壤的能力受到国内外学者的广泛关注［18-20］。研究发现，重金属通过AM真菌菌丝的吸收作用，被固定或运输到植物体内。在某些情况下，AM真菌有助于重金属在菌丝壁和土壤中的固化和吸附［21-23］。AM真菌通过与大多数植物的根建立共生关系，提高植物根系吸收面积［24］，促进植物光合作用［25］，改善植物的营养状况和生理代谢水平［26-27］，在重金属衰减过程中发挥作用。王凯渊等［28］研究发现接种AM真菌可以显著提高桑（Morus alba）株生物量和矿质营养的积累，促使Cd集中在根部，与Cd浓度存在显著正相关关系，且具有不均匀的分布、迁移的规律。本试验通过AM真菌与黑麦草对重金属污染土壤的联合修复，发现AM真菌联合黑麦草可以促进对土壤中Cd的吸收，且不同AM真菌种类对Cd的吸收效果不同，其中FM处理效果较好。但对于不同AM真菌与植物形成共生体所表现的差异性还需进一步试验研究。

3.2 AM真菌处理对植物光合荧光和生长的影响

AM真菌能促进重金属Cd胁迫下植物的生长。接种AM真菌对黑麦草株高、干物质重量、植物N含量、叶绿素含量、叶绿素荧光Fv/Fm值和Fv/Fo值、光合参数（Pn、Tr、Gs）以及生理活性的提高具有显著效果。叶绿素是植物进行光合作用的主要物质，代表植物光合潜力。在本试验中，随Cd浓度（0～30 mg·kg-1）的增加，叶绿素含量呈现下降趋势，这可能是Cd影响了叶绿体的合成途径，一些叶绿素合成酶的缺失或者活性降低使叶绿素快速分解。Pn、Tr、Ci、Gs是评价植物进行光合作用强弱的最直观的指标。本试验中，随着Cd浓度的增加，Pn、Tr和Gs逐渐降低，这表明与Cd胁迫下叶绿素含量的降低有明显关系；Ci增加，表明在Cd胁迫下，非气孔因素是影响植物光合作用的决定因素，这与铁得祥等［29］在研究不同Cd浓度下桢楠（Phoebe zhennan）幼树光合变化的情况一致。本试验条件下，叶绿素荧光参数Fv/Fm值、Fv/Fo值表现一定的下降趋势，表明Cd胁迫能抑制PSⅡ光合活性以及电子运转等过程。接种FM、GV以及FM+GV后，黑麦草根系与菌丝紧密集合，促使根系吸收更多的营养物质，进而提高叶绿素含量，增强光合作用。对于其他光合作用相关指标的变化趋势还需进一步试验证明。

3.3 AM真菌处理对植物N吸收和生理酶活性的影响

植物在储存和转移能量、光合作用、生理酶活性调节和碳水化合物的运输等过程中都需要N［30］。本试验发现，菌根植物对N的吸收显著高于非菌根植物。AM真菌通过促进N吸收，并向寄主传递一定比例的N，提高了寄主植物的营养状况。胡振琪等［31］发现接种菌根后苜蓿（Medicago sativa）的地上部N、P、K含量和地下部的N吸收量明显高于其他处理和空白对照，证实AM真菌能够促进苜蓿的养分吸收。因此，菌根真菌可以通过提高N的吸收，在污染土壤的植物修复中发挥重要作用。此外，当植物生长发育的过程中受到不良条件侵害时，细胞膜会迅速做出反应，调节和控制物质运输以及能量的交换，其中超氧根（O2-）以及羟基（OH-）等物质对植物生长产生抑制作用，造成膜脂过氧化以及抗氧化酶失活等问题。植物本身存在防御系统，其中SOD、POD等防御性酶以及可溶性蛋白等物质会修复细胞系统，维持植物体平衡。本试验发现，随着Cd浓度的增加，SOD活性和可溶性蛋白含量显著下降，而POD活性和MDA含量则显著增加，表明重金属Cd胁迫下植物细胞中的O2-以及OH-等物质会使SOD活性降低，可溶性蛋白合成途径受阻。而接种AM真菌能缓解Cd胁迫，增加SOD、POD活性和可溶性蛋白含量，这主要是因为菌根共生体帮助寄主植物吸收N等营养物质，庞大的菌丝网络延长了根系吸收范围，加强对O2-以及OH-的清除能力。

4 结论

由上可知，AM真菌通过与黑麦草建立共生关系，改善植株营养状况，促进对N的吸收，增加植株体内的叶绿素含量以及PSⅡ光化学荧光参数，同时增强了黑麦草叶片净光合速率、蒸腾速率和气孔导度，显著增加植株的生物量。此外，AM真菌主要通过根系吸附固持重金属Cd的能力，降低Cd自下而上的转移能力，从而减轻重金属Cd的毒害能力。供试条件下，FM+GV处理的黑麦草抗Cd能力较强，改善植物光合和生理效应较为显著。