夏季遮阴对茶园土壤丛枝菌根多样性及茶叶品质的影响

孙小红，王国夫，夏 何，余晓伟，朱琰麟，吴邵晗，王凌峰

（绍兴文理学院元培学院，浙江 绍兴 312000）

0 引言

【研究意义】 茶叶的产量和品质易受外界环境的影响，如强光照和高温干旱天气制约茶区的茶叶产量和品质[1]。目前市场上多以春茶为主，夏茶较少。其主要原因是夏秋季节气温较高，光照强度大，茶树碳代谢增强，氮代谢被抑制，使鲜叶中氨基酸含量减少，茶多酚含量增多，从而使酚氨比值增大，导致夏茶苦涩味重；同时由于叶绿素合成减少，茶叶颜色干枯，品质较差，导致经济效益低。因此，探索提升夏季茶叶品质研究尤为重要。【前人研究进展】近年来国内外很多茶园通过种植遮阴树、设置遮阴网、茶果间作等措施，对茶树生长、茶园环境与茶叶品质等的影响进行了研究[2−4]，取得了一定成果。在夏季进行遮阴处理能有效降低茶园光照强度，提高土壤含水量，降低土壤温度，茶叶生长良好，从而提高茶叶品质和经济效益[5]。但是现代农业大量施用含氮化学肥料，导致茶园土壤中Ca、Mg等离子以及微量元素相对缺少，而铝、氟和多酚类物质逐渐富集和累积，使茶园土壤微生物总量和多样性减少，导致茶园土壤肥力退化和养分失衡，直接制约茶园的可持续发展[6−7]。丛枝菌根真菌（Arbuscular mycorrhizal fungi, AMF）在土壤中广泛存在，能与大部分植物结成共生体。研究表明，茶树根际土壤中存在多种AM真菌[8]，丰富的AM真菌种群能够改善土壤的理化性质，促进植物吸收利用矿质养分和水分，促进植物生长发育、增强环境耐受力[9]。AM 真菌受耕作方法和施肥方法的影响，在人为影响较少的土壤中能表现出更高的多样性[10]。【本研究切入点】目前对于夏季茶园遮阴后对茶园土壤养分、茶园AM真菌以及茶叶品质影响研究较少。【拟解决的关键问题】本试验通过研究遮阴条件下土壤养分、AM真菌多样性以及茶叶品质，进一步探索茶园夏季遮阴对茶树土壤养分、土壤丛枝菌根和茶叶品质的变化特征，以期为茶叶生产和茶园土壤的可持续利用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 供试茶园

本试验在浙江省绍兴市富盛镇茶园（120°69′E,29°90′N）进行。茶树品种为薮北，树龄 12～15 a，实验区为长方形地块，试验设置遮阴和不遮阴（对照）2个处理。采用搭棚遮阴方式，在茶园里搭建棚架，支柱为水泥柱，棚顶离地面1.8 m高。遮阴棚高 1.8 m、宽 5 m、长 20 m；对照处理宽 5 m、长 20 m，均设置3次重复。每年5月10日左右开始使用黑色遮阴网（遮光率70%），覆盖在棚面上，遮阴网在秋季（10月10日左右）去掉。试验于2016年5月开始，连续处理4年。茶园每年施一次有机肥，商品有机肥用量一般为 3 000 kg·hm−2，每年春秋各施复合肥一次，用量为 1 500 kg·hm−2。

1.2 采样方法

在遮阴处理第4年即2020年7月20日采集土壤样品。根据采样位点的地形条件，在实验区域内采用5点混合取样法，以茶树主茎为中心，在半径20～30 cm的范围内取土，去掉茶树根部表面土层，采集 0～20 cm土壤[11]，采集好的样品分别装入无菌封口聚乙烯袋，放入冰盒。在超净工作台上捡去土壤中石块、植物根系等可见杂质。然后将每个样品分成3份，1份置于4 ℃冰箱保存备用，1份置于超低温冰箱用于分析微生物群落结构多样性，1份放室内自然阴干后过筛，用于测定该区域土壤理化特性。

同时采摘1芽2叶，按照杀青、理条、干燥的工艺，加工成夏茶，置于冰箱低温保存备用。

1.3 研究方法

1.3.1 茶园土壤养分测定 采用电位法测定土壤的pH值；采用灼烧法测定土壤的有机质；采用碳酸氢钠浸提-钼锑抗比色法测定土壤有效磷；采用氢氧化钠碱熔-钼锑抗比色法测定土壤全磷；采用凯氏定氮法测定法测定土壤全氮；采用碱解-扩散法测定土壤水解氮[12]。

1.3.2 土壤 AM 真菌多样性测定 土壤 AM 真菌的DNA 提取采用 ZR Fecal DNA MiniPrep™ Kit试剂盒（Zymo Research；货号：D6010），按照说明书步骤进行提取将其用于扩增。提取土壤总 DNA 用于nested-PCR，经过3次PCR扩增，引物见表1[13]。

表1 nested-PCR 引物Table 1 Primers used in nested-PCR

取第 3 次 PCR 产物经过 QIAquick Gel Extraction Kit进行纯化并进行电泳分离，快速银染后，进行DGGE凝胶图片的拍照。切胶回收采用 QIAEX II Gel Extraction Kit。切胶回收、连接pBlue-T载体（北京艾德莱生物科技有限公司）、转化化学感受态细胞DH5α，PCR 筛选后拿去 TaKaRa公司进行测序，比对基因库，找出与目的片段相似度高的菌种。

1.3.3 茶叶质量测定方法 叶绿素含量测定采用分光光度法，测定试液在645 nm和663 nm处的吸光度并计算[14]。茶多酚含量测定参照 GB/T 8313—2018《茶叶中茶多酚和儿茶素类含量的检测方法》；氨基酸含量测定参照 GB/T 8314—2013《茶游离氨基酸总量的测定》，咖啡碱测定参照GB/T 8312—2013《茶咖啡碱测定》。

1.4 统计方法

数据分析采用 Excel 2010 和 SPSS 22.0 统计软件，采用单因素多重比较检验(α= 0.05)处理间的差异显著性，使用Quantity One软件进行DGGE条带数字分析以计算样品中可检测到的DGGE条带数量。采用biodap软件公式计算香农多样性指数、辛普森多样性指数。具体计算公式如下：

Hshannon代表香农多样性指数，Dsimpson代表辛普森多样性指数，ni为 DGGE 图谱中条带的轨迹定量值，N为所有条带的轨迹定量值ni之和，Sobs代表DGGE所有检测出来的条带总数。

2 结果与分析

2.1 茶园遮阴对土壤养分的影响

如表1所示，遮阴与未遮阴茶园土壤pH分别为4.5和3.9，均小于等于4.5，都有酸化倾向，未遮阴处理的茶园土壤pH值低于遮阴的茶园土壤，但差异不显著。从表2中可以看出，遮阴后茶园有机质增加17.8 %，反映出夏季遮阴为茶树提供了较高的土壤肥力环境。经过遮阴处理的茶园土壤平均碱解氮含量、全氮含量、全磷含量和有效磷含量均显著高于未经遮阴处理的茶园土壤，分别增加了为77.86 %、163.6 %、45.45 %、27.80 %。试验表明，茶园夏季遮阴对增加土壤养分及增加土壤有机质均具有显著作用。

表2 茶园土壤养分含量Table 2 Contents of nutrients in plantation soil

2.2 茶园遮阴对土壤AM真菌多样性的影响

由图1可知，未遮阴处理的茶园土壤DGGE指纹图谱的颜色深度以及条带数目要明显高于遮阴处理组，代表该样品中AM真菌种类较多。各处理土壤AM真菌多样性指数如表3所示。其中，未遮阴处理组的土壤环境中AM真菌多样性和丰富度均显著高于遮阴处理组，表明未遮阴处理的茶园土壤环境中 AM真菌菌群的数量远多于遮阴处理的土壤组。遮阴处理的土壤样品DGGE优势条带与未遮阴处理的土壤样品中出现的相应条带不在同一水平，同时颜色深度各异。

表3 茶园土壤AM真菌DGGE条带香农指数、均匀度及丰度Table 3 Shannon index, richness, and evenness of plantation soils based on DGGE bands

图1 茶园AM真菌DGGE图谱Fig.1 DGGE banding patterns of arbuscular mycorrhizal fungi in plantation soils

为了更准确地了解遮阴对茶园土壤环境中AM真菌菌群的影响，将DGGE图谱中的部分条带进行回收，结果见表4。茶园土壤DGGE条带比对显示：大部分条带所代表的菌群属于未培养的球囊霉属AM真菌。条带2-16代表的AM真菌菌群均属于球囊霉属（Glomus），条带14所代表的菌群与球囊霉属相似性高达98.29%。其中，条带3、4和11所代表的菌种归属于同一菌种。同时遮阴和不遮阴处理的土壤样品检测显示它们之间有共同的条带，如条带21和22都不是AM真菌。同时在遮阴处理组检测到了水生子囊菌（Distoseptispora aquatica strain）、淡红丛枝瑚菌（Ramaria rubella）和未培养近微孢虫菌属（Uncultured Paramicrosporidium）。水生子囊菌（Distoseptispora aquatica strain）是依赖于水环境的真菌[15]。

表4 茶园土壤AM真菌DGGE 条带序列对比Table 4 Sequences of arbuscular mycorrhizal fungi DGGE bands in plantation soil

2.3 夏季遮阴处理对茶叶生化成分的影响

茶叶中，由于叶绿素含量不一样，所以茶叶的外观色泽和汤色都有着不同。茶叶中的叶绿素，其合成的客观因素是太阳光线。采取遮阴的方法，可以阻挡一部分的光线照射，使茶叶较小受到太阳光线的作用，可以促使茶叶中叶绿素含量的增加。从表5可知，经过遮阴处理的茶叶和不遮阴处理的茶叶中叶绿素a和叶绿素b以及叶绿素总量均有显著增加。同时遮阴后茶叶中的氨基酸含量增加显著，超过不遮阴处理组33.16%，可见夏季短暂遮阴有利于氨基酸的积累。

茶汤的滋味浓度直接影响着茶叶品质的优次，通常认为决定茶汤滋味的主体成分是茶多酚，而这种影响是由于茶多酚和氨基酸的总量及组成比例的关系所决定的。由表5可知，未经过遮阴处理的茶叶中茶多酚类物质含量较经过遮阴处理的茶叶含量高，对酚氨比计算结果表明遮阴茶园中茶叶酚氨比显著小于非遮阴茶园模式，说明遮阴茶园的茶叶较对照处理茶叶味更浓而鲜爽。另外未遮阴茶叶中咖啡碱含量低于经过遮阴处理的茶叶。

表5 不同遮阴处理下茶叶主要内含物质含量Table 5 Effect of shading on chemical composition of tea

3 讨论与结论

土壤有机质是土壤肥力的重要特征，是影响土壤理化、供肥保肥能力和养分有效性等的关键因子[16]。遮阴茶园土壤有机质含量远高于未遮阴的土壤，且遮阴处理后土壤水解氮、全氮、全磷、有效磷等主要矿质营养元素含量均显著高于未遮阴的土壤。以往研究也发现遮阴有利于有机物的积累，同时土壤有效态氮、磷、钾含量增加[17]，与本研究结果类似。在夏季高温对茶园进行遮阴处理，不光改善茶园空气温湿度，同时还明显影响茶园不同土层土壤温湿度，较低的温度缓解了土壤有机质的分解和茶树的呼吸消耗，有利于物质的积累[18]。

土壤 pH 值与土壤肥力、微生物活性以及植物生长等密切相关。土壤有机质是缓解酸性土壤 pH 主要的影响因子之一[19]，研究表明土壤有机质含量增加，可以有效缓解土壤酸化趋势[20]。

本研究表明，夏季遮阴使土壤pH值升高，这可能与遮阴后土壤有机质含量升高有关。茶园最佳pH应当在4.5～5.5 的范围，土壤酸化易造成土壤肥力下降，重金属含量增加，从而影响茶树生长发育[21−22]。本试验中茶园遮阴处理时间为每年最热的5个月，在此时间内，遮阴处理使土壤pH上升到4.5，有助于缓解茶园土壤酸化问题。

茶园根际土壤AM真菌是一个复杂的有机体。遮阴茶园土壤AM真菌指数和丰富度都低于未遮阴茶园，这些结果表明夏季遮阴处理反而降低茶园土壤样品的AM真菌丰富度及多样性，说明人为长期遮阴可能反而影响茶园土壤AM真菌多样性，目前有关人为遮阴对土壤AM真菌多样性影响研究资料较少。在对高寒草甸退化指示物种黄帚橐吾的菌根生态学研究中以及其他植物群落研究发现[23]，长期遮阴降低了根内AM真菌的物种丰富度，遮阴可弱化黄帚橐吾与AM真菌的共生关系，从而影响AM真菌的丰富和好多样性等。另外研究发现遮阴情况下接种 AMF可以改变茶树的生长环境并提高茶叶品质[24]，但目前尚不清楚单纯遮阴对茶园丛枝菌根多样性的影响机制。同时本试验中出现了水生子囊菌（Distoseptispora aquatica strain）等依赖于水环境的真菌，可能与遮阴处理后茶园土壤环境湿度增加有关，另外也可能与本试验中AMF引物的特异性不强有关。进一步试验需要选择特有性更强的引物。

绿茶最主要的品质要素是色泽和滋味。经过遮阴处理的茶叶叶绿素总量显著增加。由此可见茶园遮阴有利于茶叶中叶绿素的合成，有利于绿茶“三绿”（外形色泽绿、汤色绿、叶底绿）品质的形成[6]，提高茶叶的质量。形成茶汤鲜爽滋味的主要成分是氨基酸，该成分对组成绿茶滋味具有重要作用，同时能缓解绿茶的苦涩味，增强其甜味，对茶叶天然香气的形成也起重要作用[25]。茶园中适度的遮阴可以使茶叶中的咖啡碱含量上升，茶多酚含量下降[4]，本研究中存在同样的变化趋势。研究发现夏季适度遮阴，可以改变茶园中光、温、湿等环境条件，会使氮代谢加强，有利于茶树新梢中氨基酸的积累[6]；另一方面使茶树呼吸代谢和酶系统活性减弱，抑制茶多酚合成，使茶多酚含量下降。由此茶叶中多酚类化合物含量下降，氨基酸总量增加，从而使酚氨比变小，绿茶苦涩味减少，使茶汤鲜爽，并具有较高香气[26]。本试验中遮阴茶园中茶叶氨基酸含量较对照高，酚氨比较对照低，茶叶品质比对照优良，与文献报道类似[27]。

在长期发展中，茶树形成了喜温、喜湿、喜阴和喜漫射光的特性。夏暑季节实施遮阴，缩短了温湿度日较差，从而改善茶园环境条件，避免连续的高温干热天气对茶树造成的热害和旱害。适度遮阴可以促进茶树生光合作用的进行，有利于积累有机物；通过遮阴，可以增加茶叶中叶绿素和氨基酸的含量，减少茶多酚含量，从而提高茶叶的品质。在实际生产中，遮阴技术这一农艺措施简便易行，特别对夏秋茶园土壤性质以及夏茶的品质有明显的改善作用，可以进一步推广应用于生产中。但茶园土壤AM真菌多样性有下降趋势，有关遮阴对茶园AM真菌影响趋势值得进一步研究。