离子液体双水相体系结合UPLC检测食醋中杂环胺的方法

李敏，徐东明，杨钰雯，贺姗姗，齐改改

郑州轻工业大学 食品与生物工程学院，河南 郑州 450001

0 引言

杂环胺(Heterocyclic Aromatic Amines, HAAs)是高蛋白类食物在长时间高温烹饪条件下，食物中的氨基酸、糖、肌酸等前体物质经过美拉德反应生成的一类有害物质，具有比苯并芘、黄曲霉毒素等更强烈的致突变性，国际癌症研究机构将其分为人类可疑致癌物(2A级)和人类潜在致癌物(2B级)两大类，研究者至今已分离鉴定出超过30种HAAs[1-3]。HAAs在日常食用的煎炸[4-5]、烧烤[6-7]类食品中居多，但在奶酪[8]、酒[9]、酱油[10]、食醋[10]、大气颗粒物[11]、香烟烟气[12]、人类尿液[13]、水[14]等样品中也曾检测到。目前，HAAs的检测方法主要包括高效液相色谱法(UPLC)[15]、气相色谱法[16]、气相色谱-质谱联用[17]、液相色谱-质谱联用[18]等。由于样品基质复杂，HAAs含量水平很低(以ng/g计)，所以在对HAAs进行定量分析前，需对样品进行预处理。目前，常用的HAAs预处理方法主要包括液液萃取[19]、固相萃取[20]、固相微萃取[21]等，但这些方法需使用有机溶剂，易造成环境污染。因此，亟需开发一种绿色环保、快速高效的检测方法，以快速评价食品的卫生质量，降低误食HAAs的风险。

离子液体作为一类新型的绿色溶剂，具有良好的热稳定性及不易挥发、液程范围宽、性质可调控、可再生循环使用等优点[22]，基于离子液体的液相微萃取技术在物质定量分析中成为新的发展趋势。其中，由离子液体与双水相萃取技术相结合形成的离子液体双水相体系在食品、生物、环境等样品分析预处理中显现了广阔的应用前景。J.Han等[23]建立了1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐([C4MIM]BF4)结合(NH4)2SO4的离子液体双水相体系用于萃取牛奶、蜂蜜、肉中磺胺类药物的方法。崔运成等[24]建立了离子液体双水相体系用于萃取环境水样中痕量邻苯二甲酸二乙酯(DEP)的方法。王军等[25]建立了由新型离子液体N-乙基-N-丁基吗啉四氟硼酸盐([Nebm]BF4)与KH2PO4相结合的离子液体双水相体系用于萃取牛血清白蛋白(BSA)的方法。以上研究表明，离子液体双水相体系是一种萃取率高、绿色环保、操作简单的样品预处理技术，但目前尚未见将离子液体双水相体系应用于HAAs定量分析的相关报道。基于此，本研究拟采用单因素试验和正交试验确定离子液体双水相体系的最佳萃取条件，并结合UPLC检测食醋中较为常见的两种HAAs(1-甲基-9H-吡啶并[3, 4-b]吲哚(Harman)和9H-吡啶并[3, 4-b]吲哚(Norharmane))，以期建立一种绿色环保、快速高效的HAAs检测方法，为HAAs的定量分析提供新的研究思路。

1 标准品溶液配制

分别称取Harman和Norharmane标准品(纯度>98%，加拿大Toronto Research Chemicals公司产，精确至0.01 mg)于25 mL容量瓶中，用甲醇(色谱纯，赛默飞世尔科技(中国)有限公司产)定容至刻度线，混合均匀，得到混合标液Ⅰ，其质量浓度为0.40 mg/mL；分别吸取5.00 mL、2.50 mL、1.00 mL、0.50 mL、0.25 mL混合标液Ⅰ于10 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度线，混合均匀，即得到一系列Harman和Norharmane的混合标液，其质量浓度分别为0.20 mg/mL(混合标液Ⅱ)、0.10 mg/mL(混合标液Ⅲ)、0.04 mg/mL(混合标液Ⅳ)、0.02 mg/mL(混合标液Ⅴ)、0.01 mg/mL(混合标液Ⅵ)，于4 ℃冰箱中贮存，备用。

2 离子液体双水相体系萃取条件的确定

下列实验采用的UPLC条件如下：色谱柱为Agilent ZORBAX XDB C18色谱柱(4.6 mm×250 mm×5 μm)；流动相由乙腈(A)和乙酸铵-乙酸缓冲液(B，pH值为4.5)组成，且V(A)∶V(B)=1∶4；柱温为30 ℃；检测波长为248 nm；流速为1 mL/min；进样体积为20 μL。

2.1 离子液体双水相构成体系的选择

笔者考查了6种离子液体(1-丁基-3-甲基咪唑溴盐([C4MIM]Br)、1-己基-3-甲基咪唑溴盐([C6MIM]Br)、1-辛基-3-甲基咪唑溴盐([C8MIM]Br)、1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐([C4MIM][BF4])、1-己基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐([C6MIM][BF4])和1-辛基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐([C8MIM][BF4])，均为分析纯，上海成捷化学有限公司产)与5种无机盐(Na2CO3、NaCl、Na2HPO4、(NH4)2SO4和K2HPO4，均为分析纯，阿拉丁试剂(上海)有限公司产)形成双水相体系的情况，此时，固定离子液体用量为300 μL，K2HPO4用量为0.5 g，体系pH值为8，超声时间为3 min。结果见表1。

由表1可知，[CnMIM]Br(n=4，6，8)和K2HPO4能够快速形成界面清晰的上、下相，且形成的离子液体双水相体系稳定。[CnMIM]Br(n=4，6，8)和Na2CO3也能形成离子液体双水相体系，但分层较慢且上、下两相界面模糊。[CnMIM][BF4](n=4，6，8)和(NH4)2SO4能形成离子液体双水相体系，但在同等条件下与[CnMIM]Br(n=4，6，8)和K2HPO4形成的离子液体双水相体系相比，其萃取不完全、萃取量较低，这可能是因为[CnMIM][BF4]的极性低于[CnMIM]Br，不适合萃取HAAs。因此，最终选择[CnMIM]Br(n=4，6，8)和K2HPO4形成的离子液体双水相体系进行后续实验。

表1 双水相体系情况

针对确定的双水相体系，笔者采用食醋样品中加标(混合标液I)的方式，固定离子液体用量为300 μL，K2HPO4用量为0.5 g，体系pH值为8，超声时间为3 min，进一步考查了3种含有不同烷基链的离子液体([C4MIM]Br、[C6MIM]Br、[C8MIM]Br)对Harman和Norharmane的萃取效果。结果显示，[C8MIM]Br-K2HPO4离子液体双水相体系出峰无规律，不利于Harman和Norharmane的检测。[C4MIM]Br和[C6MIM]Br对Harman和Norharmane的萃取效果如图1所示。由图1可以看出，同等条件下，Harman和Norharmane的萃取量随着烷基链的增加而增加。因此，最终选用[C6MIM]Br-K2HPO4形成的离子液体双水相体系进行后续实验。

图1 [C4MIM]Br和[C6MIM]Br对Harman和Norharmane的萃取效果

2.2 [C6MIM]Br用量的选择

离子液体的用量决定着能否将食醋中的Harman和Norharmane提取完全，也是决定提取效率的关键因素。笔者采用食醋样品中加标(混合标液Ⅰ)的方式，固定K2HPO4用量为0.5 g，体系pH值为8，超声时间为3 min，考查了[C6MIM]Br用量(100～500 μL)对Harman和Norharmane萃取效果的影响，结果如图2所示。由图2可以看出，当[C6MIM]Br用量为100～200 μL时，萃取量随着[C6MIM]Br用量的增加而增加，呈正相关趋势；当[C6MIM]Br用量为200～400 μL时，萃取量基本保持不变；当[C6MIM]Br用量为400～500 μL时，萃取量增加不明显。因此，在综合考虑萃取量、富集倍数的前提下，选择[C6MIM]Br用量为200 μL。

图2 [C6MIM]Br用量对Harman和Norharmane萃取效果的影响

2.3 K2HPO4用量的选择

双水相体系的形成依赖无机盐的加入，无机盐会使离子液体相析出而单独成相，同时降低目标物在水相中的溶解度，使目标物转移到富离子液体相中，从而实现富集、分离的目的[26]。笔者以上相与下相之比(Vupper/Vbottom)作为指标，采用食醋样品中加标(混合标液Ⅰ)的方式，固定[C6MIM]Br用量为200 μL，体系pH值为8，超声时间为3 min，考查了K2HPO4用量(0.1～1.0 g)对Harman和Norharmane萃取效果的影响，结果如图3所示。由图3可以看出，当K2HPO4用量为0.1～0.3 g时，不能形成离子液体双水相体系；当K2HPO4用量为0.5 g时，Vupper/Vbottom达到最大值。因此，选择K2HPO4用量为0.5 g。

图3 K2HPO4用量对Harman和Norharmane萃取效果的影响

2.4 pH值的选择

当目标物为弱碱性或弱酸性物质时，体系pH值会影响目标物在溶液中的存在形式，进而影响萃取效果[27-28]。HAAs是弱碱性物质，合适的pH值有利于HAAs的萃取，进而达到更好的萃取效果。笔者通过加入适量的氨水(分析纯，天津市富宇精细化工有限公司产)溶液调节离子液体双水相体系的pH值，采用食醋样品中加标(混合标液Ⅰ)的方式，固定[C6MIM]Br用量为200 μL，K2HPO4用量为0.5 g，超声时间为3 min，考查了体系pH值(6、8、10、10.5和11)对Harman和Norharmane萃取效果的影响，结果如图4所示。由图4可以看出，当体系pH值为10时，萃取量最大，这可能是因为Harman的酸度系数(pKa)为8.62，Norharmane的pKa为7.85，此时Harman和Norharmane均以游离碱形式存在，利于被[C6MIM]Br萃取到离子液体双水相体系的上相。而当体系pH值>10时，萃取量反而下降，这可能是因为体系中碱性过强会破环离子液体的结构而降低离子液体的萃取容量。因此，选择pH值为10。

图4 pH值对Harman和Norharmane萃取效果的影响

2.5 超声时间的选择

超声时间的长短也会影响目标物的萃取量，超声时间太短易导致萃取不完全，超声时间太长又会造成资源的浪费。笔者采用食醋样品中加标(混合标液Ⅰ)的方式，固定[C6MIM]Br用量为200 μL，K2HPO4用量为0.5 g，体系pH值为10，考查了超声时间(1 min、3 min、5 min、7 min和9 min)对Harman和Norharmane萃取效果的影响，结果如图5所示。由图5可以看出，超声时间对Harman和Norharmane的萃取效果影响不明显。综合考虑选择超声时间为3 min。

图5 超声时间对萃取效果的影响

2.6 正交试验优化

为了继续探究Harman和Norharmane的最佳萃取条件，在单因素试验的基础上，采用食醋样品中加标(混合标液Ⅰ)的方式，进一步以Harman、Norharmane萃取量为考查指标，选择[C6MIM]Br用量(A)、K2HPO4用量(B)、pH值(C)3个因素设计L9(33)正交试验，正交试验因素和水平见表2，正交试验结果见表3和表4。由表3和表4可知，影响Harman萃取量的主次因素依次为[C6MIM]Br用量、K2HPO4用量、pH值，最佳萃取条件组合为A2B1C2；影响Norharmane萃取量的主次因素和最佳萃取条件组合均与Harman相同。因此，确定Harman、Norharmane的最佳萃取条件为[C6MIM]Br用量200 μL，K2HPO4用量0.5 g，pH值10。

表2 正交试验因素和水平表

表3 Harman正交试验结果

表4 Norharmane正交试验结果

3 离子液体双水相体系结合UPLC检测方法的建立

经单因素试验和正交试验，得出离子液体双水相体系最优条件，其萃取过程如下：吸取1 mL食醋(购自郑州市某超市，调节其pH值为10)于2 mL离心管中，依次加入200 μL离子液体溶液(准确称取10.00 g离子液体，用水溶解后，定容至10 mL容量瓶中)和0.5 g K2HPO4，涡旋混溶后，置于数控超声波清洗器(KQ5200DE型，昆山市超声仪器有限公司产)中超声3 min。然后将离心管置于离心机中，于8000 r/min条件下离心2 min，用微量注射器吸取富离子液体相(上相)并记录其体积，经0.22 μm滤膜过滤至样品瓶中，待测。采用UPLC检测待测样品，即得检测食醋中Harman和Norharmane的方法。

4 方法学评价

4.1 标准曲线及检出限、定量限

取各个质量浓度的混合标液Ⅰ～Ⅵ进行UPLC检测(进样量均为20 μL)，以质量浓度对峰面积绘制标准曲线。Harman的线性方程为y=185.3x+230.5，线性范围为10.0～400.0 μg/mL，相关系数R2为0.999 5，；Norharmane的线性方程为y=162.1x+199.0，线性范围为10.0～400.0 μg/mL，相关系数R2为0.999 5。结果表明，在设定的范围内，Harman和Norharmane的质量浓度与峰面积呈现良好的线性关系。将Harman和Norharmane混合标液Ⅰ逐级稀释并进行UPLC检测，直到测定的信噪比(S/N)=3时即为检出限(LODs)，S/N=10时为定量限(LOQs)。结果显示，Harman的LODs为0.50 μg/mL，LOQs为0.67 μg/mL；Norharmane的LODs为0.45 μg/mL，LOQs为0.64 μg/mL。

4.2 精密度评价

使用微量进样器精确量取30 μL Harman和Norharmane混合标液Ⅰ，采用优化后的离子液体双水相体系进行萃取。吸取20 μL上相进行UPLC检测，1 d内平行检测6次，根据峰面积计算日内精密度；保持该方法不变，1 d 1次连续测定6 d，根据峰面积计算日间精密度。Harman和Norharmane日内精密度的相对标准偏差(RSD)均为0.04%，日间精密度的RSD均为1.4%，表明优化后的检测方法精密度良好。

4.3 重复性评价

取同一批食醋样品6份，采用优化后的离子液体双水相体系进行预处理，吸取20 μL上相进行UPLC检测，记录Harman和Norharmane的峰面积，并计算其RSD。Harman和Norharmane精密度的RSD均小于3%，表明优化后的检测方法重复性良好。

4.4 回收率评价

在6份食醋样品中分别加入20 μL、25 μL和30 μL的Harman和Norharmane混合标液I，采用优化后的离子液体双水相体系进行萃取，上相经0.22 μm滤膜过滤至样品瓶中，进行UPLC检测(进样量为20 μL)。Harman和Norharmane的加样回收率为74.5%～96.3%，RSD为0.5%～2.5%，表明优化后的检测方法回收率良好。

4.5 方法验证分析

使用本文检测方法分别对超市4种食醋中的Harman和Norharmane进行检测，均未检出Harman和Norharmane。在后期研究中，还应增加所检测HAAs的种类，随机抽查多个食醋样本，并对结果进行统计学分析。

5 结论

本文建立了一种离子液体双水相体系结合UPLC快速检测食醋中Harman和Norharmane的方法，采用单因素试验和正交试验确定了离子液体双水相体系的最佳萃取条件：选用[C6MIM]Br-K2HPO4为离子液体双水相体系，[C6MIM]Br用量为200 μL，K2HPO4用量为0.5 g，pH值为10，超声时间为3 min。在此条件下，Harman和Norharmane的线性范围均为10.0～400.0 μg/mL，LODs分别为0.50 μg/mL和0.45 μg/mL，精密度、重复性和回收率均良好。该方法不使用挥发性有机溶剂，具有绿色环保、耗时短、操作简单等特点，可为HAAs的定量检测分析提供新的研究思路。由于食醋中HAAs的来源及形成机制尚无定论，本研究结果还可为进一步研究食醋中HAAs来源与致癌风险的关系、HAAs的减控措施提供参考。