水稻稻瘟病抗性基因座Piz和Pik的探秘之旅

田大刚

(福建省农业科学院生物技术研究所， 福建 福州 350003)

由稻瘟病菌引起的水稻稻瘟病是水稻生产上最具破坏性的病害之一。在流行年份大大降低了水稻产量和稻米品质，病害暴发时几乎无法控制。对水稻生产者来说，避免由此造成的经济损失是一个巨大的挑战。在防治该病害的措施中，培育抗稻瘟病品种是经济和环境友好的首选策略[1]。水稻对稻瘟病的抗性符合“基因对基因”互作模式，这使得抗性基因会因稻瘟病菌生理小种的快速变异而快速失去抗性，并由此导致抗病育种的进展缓慢，严重地影响了农业生产的需求。因此，不断挖掘和利用新型稻瘟病抗性基因，将有助于解决这一难题。

自20世纪末以来，分子遗传学技术在农作物上的应用大大加快了水稻抗稻瘟病研究的步伐。目前，水稻中已有超过130个抗性基因和350个数量性状位点(QTL)定位在所有染色体上[2-3]；然而，大多数抗性基因的抗性水平较低，大部分功能还有待验证。在水稻中目前已克隆的26个主效抗性基因中，大多数编码具有核苷酸结合位点(NBS)和富亮氨酸重复结合域(LRR)的蛋白质，并且许多NBS-LRR型抗性基因作为等位基因位于同一基因座上[4]，其中以第6染色体的Piz基因座和第11染色体的Pik基因座最为突出。Piz基因座含有Pi9、Pi2、Pi50、Piz-t和Pigm等抗性基因，Pik基因座包含Pi1、Pik、Pik-m、Pik-p、Pik-s、Pik-h和Pike等抗性基因，这两个基因座的大多数基因已被证实具有广谱抗性，在抗病育种中具有较大的应用潜力[5-6]。Piz和Pik基因座上的稻瘟病抗性基因Pi9、Piz-t和Pik/km/kp的有效性取决于其对应的无毒基因AVR-Pi9、AVR-Piz-t和AVR-Pik/km/kp，目前已发现AVR-Pik主要有AVR-Pik-A、AVR-Pik-B、AVR-Pik-C、AVR-Pik-D、AVR-Pik-E和AVR-Pik-F等多个等位基因，并有报道AVR-Pik/km/kp和AVR-Piz-t通过基因获得/缺失、碱基替换和转座子插入等多种方式来逃避抗性基因的识别[7-11]。

为促进Piz和Pik基因座上的功能基因在生产上的广泛应用，本课题组自2008年以来采用分子生物学、植物病理学和多组学的研究方法，一直在对它们的抗性机制和育种应用进行相关的研究。本文回顾了本课题组在稻瘟病抗性基因鉴定与筛选、新型抗性基因挖掘、功能基因标记开发和标记辅助改良抗性等方面的研究工作，以及水稻抗病基因及稻瘟病菌无毒基因的研究进展。

1 水稻稻瘟病抗性资源的筛选与鉴定

由于稻瘟病菌的遗传复杂性和易变性等特点，造成利用单一主效基因的抗病品种在推广应用3～5年后易丧失抗性，引起病害的暴发和流行。因此，寻找广谱抗性的抗源、挖掘及利用新抗病基因是解决问题的关键。常规的抗性基因筛选利用不同的稻瘟病菌生理小种从地方品种、栽培品种或野生稻群体中进行鉴定[12]，这种依据发病表型的筛选方法费时费力，不适宜于大规模种质资源鉴定。

通过在稻瘟病重发区的田间自然鉴定，可简便快捷地初选出抗性材料，再结合基于PCR的分子标记鉴定，在确定含有已克隆基因材料的同时，可筛选出可能含有的新抗性基因种质资源。目前，该方法已用于Piz和Pik基因座的功能基因的鉴定中[13-15]。例如，福建省沙县富口镇良种场位于沙县西北部，水稻生长季节高温高湿，是稻瘟病重发、多发区，本课题组在该地从2009-2011年间对1 092份不同类型水稻种质资源进行了田间苗叶瘟和穗茎瘟的自然鉴定，筛选到中抗以上的种质资源344份；同时，利用已报道的抗性基因分子标记，确定了部分抗性种质资源源于已知的抗性基因[16]。进一步为挖掘新的抗病基因，本课题组还对筛选出来的谷丰A、闽北晚籼和02428等抗性资源进行遗传分析，确定谷丰A抗性不仅源于Pigm、Pid2和Pid3等已知基因[17]，还可能含有新基因[18-19]，闽北晚籼的抗性主要由Pigm基因贡献，而02428中发现了新单倍型的抗性基因pi21[20]。

全基因组关联研究(GWAS)有助于理解复杂数量性状和遗传变异[21-23]。在水稻中，GWAS结合高通量测序和基因敲除技术已被用于快速鉴定影响产量、抽穗期、芒长和其他农艺性状的新功能基因[24-25]。近年来，GWAS在定位水稻抗稻瘟病基因中也得到了广泛的应用。如陈学伟等[26]挖掘到1个调控广谱抗病的C2H2转录因子Bsr-d1；Wang等[27]利用从中国各地收集的16个典型稻瘟病菌株，在籼稻群体中鉴定到30个与稻瘟病抗性相关的位点；Wang等[28]通过对低SSR标记覆盖率的151份材料进行GWAS分析，确定了21个与稻瘟病抗性有关的位点，其中6个位于与已克隆的稻瘟病抗性基因的区域；Guo等[29]在对同样是SSR标记覆盖率较低的227个粳稻的稻瘟病抗性基因分析中，确定13个显著位点，其中8个是以前报道的稻瘟病抗性基因；Raboin等[30]通过对150份热带粳稻和190份籼稻品种的田间抗性评价，分别在粳稻品种的第1号、12号染色体和籼稻品种的第8号染色体上定位到3个显著的位点，并确定了2个候选基因；Kang等[31]和Zhu等[32]分别通过在室内用5个不同的稻瘟病菌株进行接种试验及在3个水稻主产区对5个主要栽培稻亚群体的420份代表性材料进行田间自然发病鉴定，前者鉴定出97个稻瘟病抗性位点，其中82个属于未报道的基因；田间鉴定出的16个稻瘟病抗性位点中，有13个也是未报道的基因。Lin等[33]利用RDP I和两个台湾稻瘟病菌株，鉴定出32个与抗瘟性有关的QTLs，其中22个与先前报道的抗性基因或QTLs重合；此外，Li等[34]利用3个中国菌株对RDP I进行了稻瘟病抗性的GWAS分析，鉴定到56个QTLs，其中1个对所有3个菌株都具有抗性，并被确定含有一个新的Pik等位基因；而Liu等[35]利用3个稻瘟病菌株对RDP II做了抗性鉴定，确定了27个与稻瘟病抗性相关的位点，其中22个为未报道的基因，并确定了1个新的抗性基因，该基因可对稻瘟病产生部分抗性。以上这些研究成果表明，GWAS技术是鉴定水稻稻瘟病新抗原的强有力工具。本课题组利用过去50年来积累的120份南方稻区主栽品种的测序数据，通过关联室内外稻瘟病抗性鉴定，获得了多个显著的区间，其中包括3个已克隆的稻瘟病抗性基因和1个新的位点(图1A)。

图1 利用多组学技术挖掘稻瘟病抗性基因和解析Piz-t抗性机制

2 水稻稻瘟病抗性基因与稻瘟病菌无毒基因的互作

在已确定的稻瘟病抗性基因与对应无毒基因的配对中，如Pi-ta/AVR-Pita、Piz-t/AVR-Piz-t、Pik/AVR-Pik、Pia/AVR-Pia、Pi33/ACE1、Pi-CO39/AVR1-CO39、Pi54/AVR-Pi54、Pii/AVR-Pii、Pi9/AVRPi9和Pib/AVRPib[36]。其中Pi-ta/AVR-Pita和Piz-t/AVR-Piz-t是单个抗性基因识别单个AVR基因[37]，而在Pik、Pi5和Pia/Pi-Co39介导的识别相应AVR基因的过程中，分别需要Pik-1和Pik-2、Pi5-1和Pi5-2以及由RGA4和RGA5组成的两个R基因共同参与。近来，Cesari等根据水稻NLRs Pikp-1和RGA5蛋白利用HMA (重金属相关的)物理结合稻瘟病菌无毒蛋白Avr-PikD、Avr-Pia和Avr1-CO39集成诱饵结构域IDs以识别稻瘟菌效应子的特性，在抗病蛋白RGA5_HMA中引入Pikp-1_HMA与Avr-PikD结合残基，为RGA5_HMA创建了高亲和力的结合表面。携带这种结合表面的RGA5变异体不仅能感知Avr-Pia和Avr1-CO39，还能识别Avr-PikD[38-39]。

值得注意的是，在CC型NLR蛋白ZAR1的蛋白质结构研究中，ZAR1识别并被病原菌蛋白AvrAC激活后，组装成含3个亚基共15个蛋白的环状五聚体蛋白机器“抗病小体”，抗病小体形成后直接在细胞质膜上发出自杀指令，很可能是植物细胞死亡和免疫执行者[40-41]。另外，结构分析表明TIR-NBS-LRR蛋白通过代谢分解辅助因子烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)，介导细胞死亡信号通路和诱导植物产生抗性[42-43]。上述结果说明了R蛋白通过多种机制介导植物的免疫反应。因此，基于结构的水稻抗稻瘟病相关蛋白的分析，可能有助于了解植物的免疫机制。例如，Zhou等[44]报道了水稻NPR1的高分辨率的三维结构，从分子水平上阐述了水稻NPR1调控抗病的基因转录机制，反映了NPR1如何与同源或异源转录子结合来调控抵抗病原菌的基因转录模型。

为研究近年来福建省稻瘟病菌生理小种组成，利用2017-2019年收集自福建省17个县市(地区)的中稻稻瘟病穗颈瘟样本分离单孢，用7个中国鉴别品种进行分类鉴定，并从中筛选出60个福建省内具有代表性的稻瘟病菌株。其中，稻瘟病菌生理小种ZA群出现频率为39.48%，为优势种群；ZB、ZC和ZD群菌株的占比分别为23.68%、13.82%和11.18%，致病力达到50%以上的生理小种分布在邵武、建阳、光泽、宁化、龙岩和松溪。这一结果说明，不同区域和年份间的稻瘟病菌菌株致病力存在差异[45-46]。

了解水稻AVR基因的分子结构及进化，对于抗病育种中合理利用抗病基因，以及采取更有效的策略来控制病害发生具有潜在的意义。通常情况下，在病原菌与植物之间长期的互作中，植物利用抗病基因来抵御病原菌，而病原菌也在试图冲破植物的防御体系，它们之间的共同进化在基因组水平上有迹可循[47-48]。稻瘟病菌利用无毒基因结构突变来适应寄主抗病基因和环境的变化[8，49-50]，因此，分析稻瘟病菌田间分离株的DNA序列变异，有助于了解水稻抗性基因的有效性和持久性。本课题组利用6个稻瘟病菌无毒基因和9个水稻抗性基因的分子标记，分别检测上杭县稻瘟病菌35个生理小种和117个近50年来南方水稻主栽品种，结合在福建上杭的田间抗性鉴定，发现AVR-Pita、AVR-Piz-t和AVR-Pik都存在变异类型菌株，它们对应的抗性基因在该地区也失去抗性；而另一方面Pigm、Pi2和Pi9基因对该地的菌株有广谱的抗性，并且在这117份水稻中含有较少的Piz基因座的功能基因，说明这些功能基因仍可以在当前抗性育种中广泛应用。

3 多组学挖掘涉及水稻Piz-t基因调控的抗病新基因

水稻受到稻瘟病菌侵染时，会通过体内的生化物质调节信号转导，进而调节其抗病相关基因的表达，这是一个由多种信号通路所调节的复杂的调控网络，单从某一方面研究无法较为完整地探究其中机理。得益于日趋发展的测序技术及手段，以高通量、大规模、高灵敏度为特点的数据分析统计方法开始大量应用于作物应答病原菌侵染的研究。在分子生物学和数据科学中，组学指的是研究发生在生物体内特殊的、暂时的或全面性的变化；它是在一个单一或一群细胞、组织或器官中衡量功能和提取相关的生物信息。水稻全基因组序列的易获得性，为基因组学、转录组、蛋白质组和代谢组学等多种组学研究提供了平台[51-60]。

对生物体完整转录组的破译始于20世纪90年代[61]。在过去30年中，利用深度测序技术的RNA-Seq方法在各种作物改良中获得了巨大的推广应用。综上所述，转录组学有助于破译未注释的基因和分析基因表达模式[62]。前期研究表明，水稻对稻瘟病菌的抗性是包括转录因子[MYB、WRKY、乙烯应答因子(ERF)等]、信号激酶、亮氨酸重复基因、细胞壁修饰相关基因等多个调节子的联合作用；同时，参与水稻抗性反应的各种防御反应基因上调[63]。但是，这些研究都缺乏水稻与稻瘟病互作的动态变化。本课题组在比较转Piz-t日本晴(NPB-Piz-t)与日本晴在接种稻瘟病菌KJ201的转录组学的分析中，确定了接菌后24 h是最特异的时间点(图1B)，该时间点最显著的蛋白-蛋白互作途径包含丝裂原活化蛋白激酶信号通路、与DNA结合结构域相关的抗病基因。进一步利用加权基因共表达网络分析确定了几个与光合作用、重要农艺性状及特异核苷酸结合域和富亮氨酸重复(NLR)基因以及与B3 DNA结合域蛋白相关的基因在抗感病之间受到差异调控[64]。

蛋白质组学由Mark Wilkins于1994年提出[65]。蛋白质组学借助于其他组学技术，如基因组学、转录组学和代谢组学去认识感兴趣蛋白的结构与功能。确切地说，蛋白质组是指细胞、组织或有机体中的一组或全部蛋白质，它提供了一个在特定条件下数据丰富的表达蛋白全景。目前蛋白质组学研究几乎涵盖了正常或胁迫条件下的所有水稻组织和器官[66]。在水稻与稻瘟病菌互作方面，蛋白质组学研究已经揭示了DUF26、核苷酸结合富含亮氨酸重复序列、病程相关基因、活性氧产生清除酶、热休克蛋白(HSPs)、核重组相关蛋白、转录因子和植物激素信号传导在水稻抗病中的作用；其中对病原体感知和信号转导相关的蛋白质在病原菌侵染的早期阶段发挥重要的作用。但在丙烯唑诱导蛋白1(PBZ1)和苯丙素在抗病和感病品种中的作用方面，iTRAQ与之前使用2-DE方法的研究结果相反，这说明需要更系统的利用iTRAQ技术去挖掘和确认这种互作中的关键因子[67]。本课题组利用iTRAQ技术比较NPB-Piz-t与日本晴在接种稻瘟病菌KJ201和RB22(KJ201和RB22分别对Piz-t表现为不致病和致病，但两者对日本晴都是致病的)后的变化[68]，获得56个在NPB-Piz-t与日本晴中都存在的差异表达蛋白，如Bowman-Birk胰蛋白酶抑制剂、C3HC4型RING家族E3泛素化酶、病程相关蛋白、与激素调节和防御及应激反应有关的蛋白质、类受体激酶和细胞色素P450等。有趣的是，NPB-Piz-t接菌KJ201和RB22之间只有少数不同的差异表达蛋白，如乙醇脱氢酶I、类受体蛋白激酶、内切几丁质酶、类Rubisco大亚基、NADP依赖型苹果酸酶和两种假定蛋白，这些蛋白可能是导致抗感性不同结果的重要因素。如Bowman-Birk胰蛋白酶抑制剂APIP4和C3HC4型RING家族E3泛素化酶APIP10都参与到Piz-t调控的免疫反应，后者不仅可以降解效应蛋白Avr-Piz-t，激活PTI[69-70]；还可与维管植物单锌指蛋白VOZ1/VOZ2互作，调控NLR蛋白Piz-t介导的ETI[71]。bZIP类型的转录因子APIP5也参与植物免疫调控[72-73]。之后，Zhang等[74]在水稻与白叶枯菌的互作研究中也做了类似的探索(图1C)。

不同于基因组学、转录组学和蛋白质组学所揭示的细胞内基因表达模式，代谢组学是利用高通量的技术来鉴定和定量一个细胞、组织或器官中所有小分子或代谢物的生命科学研究，以提供一个生物体或生物系统的生化状态全貌[75]。最值得注意的是，代谢组学能提供生物体发生的证据，并描述了生化表型[76]。本课题组在NPB-Piz-t与日本晴接种稻瘟病菌KJ201的叶片中，相对于各自接种缓冲液的对照来说，分别检测到78个和52个(含22个共同的)的差异表达代谢物。N-顺式-芥子酰酪胺和N-顺式阿魏酰酪胺是它们中两个差异最显著的物质，可作为生物防治稻瘟病害的候选。生物信息学分析发现，色氨酸代谢途径和吲哚生物碱生物合成在抗病和感病反应中差异显著[77](图1D)。多数吲哚生物碱是由色氨酸衍生而来的一类植物代谢产物[78]，它们在195种植物抵御病原菌和食草动物侵害的过程中起着关键作用[79-80]，这使得生物碱在医药中得到广泛应用[81]。除此之外，已有研究报道如月桂素3-O-纤维二糖甙、脱落酸葡萄糖苷酯、橙黄决明素-6-O-葡萄糖苷、刺苞菊甙和樱桃素等在抗稻瘟病的水稻品种中特异产生[82]，它们可作为开发稻瘟病菌生物防治药物的物质基础。

植物根部微生物组与植物免疫密切有关，加强病原微生物与有益微生物间互作的交叉研究，阐明植物识别病原菌和有益微生物的分子应答和免疫反应激发机制的差异，可为提高农作物产量与抗性提供新的途径[83]。目前尚缺乏水稻与稻瘟病菌互作对根部微生物影响相关的研究。本课题组采用16s rRNA和内转录间隔子1(ITS1)序列分析方法，对NPB-Piz-t与日本晴在接种稻瘟病菌KJ201的根内、根际土壤微生物进行了测序。除根内真菌丰富度外，根际土壤的细菌和真菌的丰富度和多样性均高于根内；接菌后的根内细菌群落丰富度和多样性有所增加，以日本晴的增加最多，而真菌丰富度和多样性降低，分别以日本晴的丰富度和NPB-Piz-t的多样性最低，且NPB-Piz-t与日本晴的根内真菌存在显著差异；共生网络分析表明，细菌和真菌群落分别以藻门变形菌和子囊菌为主[83](图1E)，该结果为利用微生物防控稻瘟病菌提供理论参考。

4 色氨酸代谢途径介导水稻广谱抗性

在上述的多组学分析Piz-t调控的抗性途径中，色氨酸途径在转录、蛋白质和代谢物等多层次水平上受到影响，表明这一途径参与了Piz-t调控的免疫反应。

由色氨酸途径生成的5-羟色胺是一种次生代谢物，易被活性氧氧化[84-85]。由于5-羟色胺抗氧化活性，其在抗病过程中起着至关重要的作用。另外，5-羟色胺也起着物理屏障的作用，使水稻对褐斑病和稻瘟病产生抗性；并在水稻对胡麻斑病的抗性反应和衰老的过程中积累[86-89]。此外，水稻植株受到害虫入侵时，会诱导5-羟色胺的生物合成；而在5-羟色胺生物合成受到抑制时，则会增强水稻植物对螟虫和稻飞虱的抗性[90]。

SL基因控制5-羟色胺的合成，课题组借助于对SL基因突变体的研究，确定了sl突变体能提高水稻活性氧爆发水平，并能通过调控水杨酸、茉莉酸、乙烯和脱落酸等物质的协调作用，增强水稻抗性。另外，sl突变体还广泛参与对胡麻斑病、白叶枯病和稻飞虱的抗性[91-95]。与SL互作的泛素化蛋白SLBP可在体内降解SL蛋白；不仅如此，在对比NPB-Piz-t与日本晴接菌KJ201的72 h时SL表达的数据时发现，SL在NPB-Piz-t中受到明显抑制；进一步分析发现SLBP可与稻瘟菌无毒蛋白AvrPiz-t互作，表明SL可能参与Piz-t调控的ETI免疫反应。

5 Piz和Pik基因座功能标记的开发及种质资源鉴定

在已克隆的稻瘟病抗性基因中，接近1/3位于Piz和Pik基因座上，这些基因多数都是广谱高抗基因；其中位于着丝粒近端的第6号染色体短臂上的Piz基因座的等位基因，如Pi2、Pi9、Piz-t和Pigm都嵌入在1个包含多个序列相关的同源基因的簇中，它们限定在LRR区域内的有限序列变异决定了它们对不同稻瘟病菌株的识别特异性[96-98]。Piz基因座的等位基因间具有高度序列化的复杂组织结构特征，使得开发区别于这些基因的分子标记十分困难。类似地，位于第11染色体长壁末端的Pik基因座的抗性基因均由2个紧密连锁但转录方向相反的CC-NBS-LRR类基因(Pik-1和Pik-2)共同决定，且基因序列间高度同源[6,15,99-100](图2)。

为促进Piz和Pik基因座所含功能基因在育种中的应用，近年来出现了多个关于这两个基因座功能基因的分子标记[14, 101-103]，但由于多数标记和基因有一定的遗传距离或者需要酶切等步骤，因此很难在大规模种质资源筛选或育种中应用。本课题组基于Piz和Pik基因座的基因序列，开发出Pi9-Pro、Pi2-LRR、Pigm/2/9InDel、Pikp-Del和Pi1-In等标记[104-106](图2)。利用这些标记系统鉴定了我国南方水稻种植区的品种及育种材料，确定了Pi2、Pigm和Pik等抗性基因尚未在水稻生产中广泛使用。这些信息不仅为下一步布局抗性基因提供试验数据，也便于利用这两个基因座所含的功能基因开展分子育种。

注：A.Piz 和Pik基因座功能基因；B.Piz 和Pik基因座功能基因标记图

6 Piz和Pik基因座用于创制水稻稻瘟病抗性新品种

分子标记辅助育种是抗病育种的重要途径，特别是针对已克隆基因的使用，大大缩短了育种周期和成本[107-110]。在早期利用已克隆稻瘟病抗性基因对福建优势菌株的抗性鉴定中，筛选出具有广谱高抗基因Pi9、Pi2和Pi1。为了加速它们在水稻生产中的应用，本课题组设计了一个基于回交转育的策略。以供体亲本C750或75-1-127(Pi9)、BL123(Pi1+Pi2)和华占(Pi2)与CBB23(Xa23)和B5(Bph14/Bph15)组合，改良抗性较弱的强优势恢复系闽恢6118、闽恢3189、恢316和闽恢3301杂交，在每个回交世代中选择携带所有目标基因的植株进行进一步回交；在每一代回交选择中，首先对目标基因进行标记选择，然后对田间农艺性状进行选择；经过5～7代回交后自交，选出目标基因纯合的植株进行抗性和农艺性状评价，获得了Pi9、Pi2和Pi1与其他抗性基因组合的品系[111-113]。经稻瘟病抗性鉴定和农艺性状调查分析，改良系在产量几乎不受影响的情况下，抗性水平得到了明显的提高。所获改良系CNA20110332.2、CNA20110330.4、CNA20110334.0和CNA20110333.1等已在生产中得到应用，对水稻的稳产高产提供了保障。

7 展望

稻瘟病一直伴随着水稻的生产，由于病害的复杂性，本课题组仍在寻找有效的防治措施。经过近15年的深入研究，已经对稻瘟病的发生规律和防治方法有了较深入的认识。通过上述的研究，稻瘟病抗病机制逐渐显现。更重要的是，本课题组和其他实验室培育了一些生产上适用的抗病品种，表明了利用分子标记辅助育种将使抗病育种更加便利、快捷、有效。

然而，目前仍有许多问题存在。由于对这些抗病基因的抗性机制尚不明确，由遗传背景导致的抗性差异的原因也不清楚；生产中使用的抗病基因数量有限，并且大多数已确定的抗性基因的防治效果较小；导致了目前抗病育种中存在着针对特定水稻种植区的可用基因数量有限和基因选择的盲目性。此外，由于抗病性状、农艺性状和品质性状均受多基因控制，而且还可能存在选择上的连锁累赘，因此如何兼顾所有性状仍是一个难题。综合运用基因编辑、合成生物、分子设计和全基因组选择可能是今后进行水稻性状综合改良的一种可行方法。