溶酶体跨膜蛋白5在卵巢癌细胞上皮-间质转化中的作用

姜晓凤，蔡鑫泽，张岩，魏力

（中国医科大学 1.附属第四医院妇科，沈阳 110032；2.附属第一医院中心实验室，沈阳 110001）

卵巢癌是女性生殖系统常见的恶性肿瘤之一，死亡率居生殖系统恶性肿瘤首位。满意的肿瘤细胞减灭术和术后以铂类为基础的化疗是目前主要的治疗方式［1-2］。寻找有效的治疗靶点是卵巢癌基础、临床研究中亟待解决的问题。

溶酶体跨膜蛋白5（lysosomal protein transmembrane 5，LAPTM5），主要定位于晚期溶酶体和核内体内，在造血组织中呈高表达，其编码基因位于染色体1p34［3］。研究发现LAPTM5在T细胞抗原受体（T cell receptor，TCR）和B细胞抗原受体（B cell receptor，BCR）的降解环节［4］，自身免疫性疾病［5］、炎症性肠病［6-7］、肿瘤细胞增殖和转移等发面发挥作用，在卵巢癌中，LAPTM5的表达及其对卵巢癌恶性生物学行为的影响尚不清楚。

肿瘤细胞上皮-间质转化（epithelial mesenchymal transition，EMT）在肿瘤细胞转移和耐药过程中发挥重要作用［8］。本研究拟探讨LAPTM5在卵巢癌细胞中的表达情况，外源性沉默LAPTM5后卵巢癌细胞EMT相关指标的变化及其对卵巢癌细胞迁移、侵袭能力的影响，旨在为卵巢癌靶向治疗提供新思路。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞：人卵巢腺癌细胞株OVCAR3购自美国组织培养库（American Tissue Culture Colection，ATCC）。宫颈癌细胞株（Hela）和弥漫大B细胞淋巴瘤细胞株（SUDHL4）购自中科院上海细胞库。

1.1.2 主要试剂：RPMI1640（美国Hyclone公司），FBS（美国Hyclone公司），PBS（美国Hyclone公司），0.25%EDTA胰蛋白酶（美国Gibco公司），DMSO（美国Sigma公司），TRIzol（日本TaKaRa公司），RNA反转录试剂盒（日本TaKaRa公 司），SYBR Premix Ex TaqTM试剂盒（日本TaKaRa公司），BCA蛋白浓度测定试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司），蛋白提取试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司），APS（美国Sigma-Aldrich公司），TEMED（美 国Sigma-Aldrich公 司），Tween20（北京鼎国生物科技有限公司），BSA（上海碧云天生物技术有限公司），兔抗人LAPTM5抗体、兔抗人β-actin抗体、鼠抗兔二抗（美国Cell signal公司），ECL发光试剂盒（上海天能科技有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 Western blotting：利用蛋白提取试剂盒分别提取OVCAR3、Hela、SUDHL4细胞总蛋白，定量后行SDS-PAGE分离目的蛋白，转移至PVDF膜，封闭20 min，加入LAPTM5一抗（稀释比例1 ∶1 000）和 β-actin（稀释比例1 ∶1 000）4 ℃过夜，加入二抗（1 ∶8 000）室温孵育1 h，洗膜后天能凝胶成像系统下发光，拍照。以β-actin为内参。采用Image J软件分析每个样本蛋白条带灰度值与β-actin条带灰度值之比，以其比值作为目的蛋白的表达水平。重复实验3次。

1.2.2 细胞转染及分组：6孔板内接种OVCAR3细胞（5×105/孔），待细胞生长至70%融合时，按照lipofectamine3000说明书，分别应用空对照质粒以及LAPTM5沉默质粒转染OVCAR3细胞，记为转染空载体对照组（si-NC）和转染LAPTM5沉默质粒组（si-LAPTM5），24～48 h后检测沉默效率。

1.2.3 RNA的提取和实时定量PCR：应用TRIzol 试剂分别提取2组细胞总RNA，加入RNase R降解线状RNA，RNA样品稀释后测定浓度。应用RNA反转录试剂盒将RNA反转录为cDNA，应用SYBR Premix Ex TaqTM试剂盒行实时定量PCR对反转录产物进行扩增。反应条件为预变性95 ℃ 2 min，95 ℃变性15 s，退火60 ℃ 1 min，40个循环。测定Ct值，以GAPDH为内参照，以2-ΔΔCt表示mRNA的相对表达量。PCR引物序列见表1。重复实验3次。

表1 相关引物序列Tab.1 Primer sequences

1.2.4 细胞划痕实验：6孔板背面用直尺划线，细胞转染后继续培养箱培养24 h，用0.25%胰蛋白酶消化制备成细胞悬液，细胞计数，铺板（5×105/孔，尽量控制细胞密度隔夜铺满板底），次日用100 μL头垂直划线，弃去培养基，PBS反复清洗3次，继续培养箱培养，分别于12 h、24 h倒置显微镜观察、拍照。重复实验3次。

1.2.5 Transwell 侵袭实验：Matrigel胶1 ∶8稀释，包被Transwell小室。细胞转染后继续培养箱培养24 h，0.25%胰蛋白酶消化，然后用无血清培养基重悬细胞，计数，调整细胞浓度至5×105/mL。取100 μL细胞悬液加入Transwell小室，24孔板下室加入750 μL含20%血清的培养基。培养箱培养24 h，取出小室，PBS清洗3次，4%多聚甲醛固定15 min，0.1%结晶紫染色20 min，棉签擦去上层未侵袭细胞，PBS清洗3次，在显微镜下计数。重复实验3次。

1.3 统计学分析

采用GraphPad软件进行统计学分析，绘制统计图，数据以表示，2组间差异采用独立样本t检验。采用Photoshop软件处理图片。P＜ 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 LAPTM5在人卵巢腺癌细胞OVCAR3中的表达情况

LAPTM5在SUDHL4细胞中呈高表达，在Hela细胞中呈低表达，以这两种细胞分别作为阳性和阴性对照进行Western blotting检测，结果显示，与Hela细胞相比，OVCAR3细胞中LAPTM5蛋白表达水平上调，差异有统计学意义（P＜ 0.01）；与SUDHL4细胞相比，OVCAR3细胞中LAPTM5蛋白表达水平略降低，差异有统计学意义（P＜ 0.001），见图1。以上结果证实，LAPTM5在OVCAR3细胞中表达上调。

图1 OVCAR3细胞中LAPTM5蛋白表达情况Fig.1 Expression of LAPTM5 protein in OVCAR3 cells

2.2 沉默LAPTM5抑制人卵巢腺癌细胞OVCAR3细胞迁移

对人卵巢腺癌OVCAR3细胞进行LAPTM5siRNA转染，并利用PCR检测转染效率，结果显示，LAPTM5siRNA能够有效沉默OVCAR3细胞中LAPTM5的表达（0.139±0.338，P＜ 0.001），见图2。随后，通过细胞划痕实验检测LAPTM5对OVCAR3细胞迁移能力的影响，结果显示，与对照组（si-NC）相比，实验组（si-LAPTM5）细胞迁移能力显著下降（P＜ 0.01）。

图2 转染质粒后OVCAR3细胞迁移能力变化Fig.2 Changes in the migration ability of OVCAR3 cells after transfection with a plasmid

2.3 沉默LAPTM5抑制人卵巢腺癌细胞OVCAR3细胞侵袭

通过Transwell侵袭实验进一步检测LAPTM5对OVCAR3细胞侵袭能力的影响，结果显示，与对照组（si-NC）相比，实验组（si-LAPTM5）细胞侵袭能力下降（P＜ 0.05），见图3。

图3 转染质粒后OVCAR3细胞侵袭能力变化Fig.3 Changes in the invasion ability of OVCAR3 cells after transfection with a plasmid

2.4 LAPTM5对人卵巢腺癌细胞OVCAR3中EMT相关标志物mRNA表达水平的影响

实时定量PCR结果显示，实验组（si-LAPTM5）细胞中EMT上皮标志物E-cadherin（3.469±0.618）mRNA表达水平较对照组上调（P＜ 0.05），间质标志物N-cadherin（0.603±0.032）和Vimentin（0.798±0.045）mRNA表达水平下调（P＜ 0.05），见图4。

图4 转染质粒后OVCAR3细胞EMT相关指标变化Fig.4 Changes in EMT-related indexes in OVCAR3 cells after transfection with a plasmid

3 讨论

LAPTM5是LAPTM家族的一员，参与蛋白质由高尔基体向溶酶体的运输过程，通过与E3泛素连接酶Nedd4相互作用，影响溶酶体和细胞质膜的分选［9-10］。文献［11-12］报道，LAPTM4β-35在肝细胞癌、乳腺癌、胃癌、肺癌、卵巢癌等多种肿瘤组织中高表达，且其表达水平与淋巴结及远端转移呈正相关。LAPTM5在食管癌和非小细胞肺癌患者中低表达［13］，有学者认为LAPTM5的失活可能与一些肿瘤的发生相关。Oncomine数据库中，人类膀胱癌组织中LAPTM5基因表达显著上调［14］。本研究结果显示，LAPTM5在人卵巢腺癌细胞OVCAR3中表达上调。

EMT过程中E-cadherin表达下调，N-cadherin、Vimentin等相关指标表达上调，细胞极性改变，细胞间黏附减少，失去正常形态，细胞迁移侵袭能力增强。EMT与卵巢癌腹膜转移以及患者术后生存率密切相关［15-16］。本研究结果显示，通过外源性沉默LAPTM5基因，人卵巢腺癌细胞OVCAR3细胞迁移、侵袭能力明显下降，此外沉默LAPTM5会影响OVCAR3细胞EMT相关指标的变化，导致E-cadherinmRNA表达上调，N-cadherin、VimentinmRNA表达下调。CHEN等［14］研究显示沉默LAPTM5能够抑制膀胱癌细胞增殖，诱导细胞周期阻滞在G0/G1期，同时发现LAPTM5的下调导致E-cadherin的增加和N-cadherin、β-catenin、Slug的减少，与本研究结果一致。本研究探讨了LAPTM5对卵巢癌细胞EMT的影响，提示外源性沉默LAPTM5可能通过抑制卵巢癌细胞EMT进而抑制卵巢癌的发生和转移。

综上所述，LAPTM5在人卵巢腺癌细胞OVCAR3中表达上调，外源性沉默LAPTM5能够抑制OVCAR3细胞EMT和迁移、侵袭能力。