联合检测血清VEGF、Ang-1和Ang-2在早期诊断异位妊娠中的价值

袁喜安 戴 旋 邹 苗 郭玉琳 王超男 颜 彬 吴绪峰 马全富

华中科技大学同济医学院附属湖北妇幼保健院肿瘤妇科 湖北 武汉 430070

异位妊娠（ectopic pregnancy，EP）是妇产科常见的急腹症之一，近年来发病率有明显升高的趋势，目前占所有妊娠的1%～2%［1］，严重影响育龄期女性的生育能力和生命安全。因此，EP的早期诊治对其具有重要的临床意义［2］。目前临床上常用的诊断方法是人绒毛膜促性腺激素（HCG）联合超声检查，但早期异位妊娠临床表现不典型，诊断较困难，40%～50%的异位妊娠患者在急诊初诊中被误诊［3］。早期诊断异位妊娠的方法除阴道超声检查、诊断性刮宫、腹腔镜探查等外，检测患者的血清标志物也是常用的预测方法。本研究旨在对早期正常宫内妊娠者和确诊EP患者的血清血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、促血管生成素（angiopoietin，Ang）-1和Ang-2浓度进行检测，探讨其在EP诊断中的价值，从而为临床提供更为简便易行、安全可靠的早期诊断方法。

1 资料与方法

1.1 研究对象选取2016—2018年在华中科技大学同济医学院附属湖北妇幼保健院妇科诊断为异位妊娠的患者53例，依据病史、体格检查，结合B超检查确诊；正常妊娠组来自门诊同期就诊共50例。两组在年龄、孕产史、体质量指数、停经时间方面的差异无统计学意义。所有对象均排除其他引起VEGF、Ang-1、Ang-2值升高的相关疾病。该实验获得了医院医学伦理委员会同意，所有研究对象实验前进行了充分告知并签字同意。

1.2 方法两组均未经任何治疗，就诊时采集空腹静脉血5 mL，3 000 r/min离心10 min，取血清置于-80℃冰箱待检。应用酶联免疫吸附试验（ELISA）法测定血清中VEGF、Ang-1和Ang-2的含量，试剂盒购自欣博盛生物公司QuantiCyto®Human VEGF ELISA kit（Lot#：H160617-108a）和美国Ray-Bio公司的Ray Bio®Human ANGPT 1 ELISA Kit（Lot#：0617160102）、RayBio®Human ANGPT 2 ELISA Kit（Lot#：0617160224）。ELISA操 作 参照试剂盒说明书，每一样本设置3个复孔，使用酶标仪（芬兰雷勃公司）检测光密度（OD）值，检测波长为450 nm。利用标准曲线法计算未知样品的浓度。

1.3 统计学方法采用SPSS 20.0统计软件进行数据处理和分析，定量资料符合正态分布的以均数±标准差（±s）表示，组间差异性的统计推断采用t检验；非正态分布以中位数（四分位数间距）［M（P25，P75）］表示，组间差异性统计推断采用非参数秩和检验。各指标诊断效力/价值的评价采用受试者工作特征(ROC）曲线分析，指标联合诊断的疾病预测模型及预测概率值计算采用二元Logistic回归。ROC曲线分析及差异的统计检验采用Med Calc 19.1软件。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 异位妊娠组母体外周血中血清VEGF、Ang-1、Ang-2浓度与早期宫内妊娠组比较异位妊娠组母体外周血中血清VEGF浓度中位数234.6 pg/mL，明显高于早期宫内妊娠组（77.3 pg/mL），差异具有统计学意义（P＜0.05），而HCG（2 096.0 U/L）和Ang-2（11.8 ng/mL）的血清水平对比正常早孕组明显降低，差异具有统计学意义（P＜0.05）。Ang-1在两组间的血清浓度差异无统计学意义（P＞0.05），见表1，异位妊娠组和正常宫内早孕组VEGF、Ang-1、Ang-2三指标的血清浓度值散点图分析见图1。

图1 异位妊娠和正常早孕组VEGF、Ang-1、Ang-2母体外周血清浓度散点图***P＜0.05

表1 异位妊娠与正常早孕组相关指标的比较

2.2 ROC曲线分析以评价VEGF和Ang-2诊断异位妊娠的效力鉴于VEGF和Ang-2在两组间的血清浓度比较有统计学意义，故将其纳入ROC曲线分析以评价其诊断异位妊娠的效力。通过ROC曲线分析得出，以VEGF单一指标诊断异位妊娠的最佳血清浓度截断值（cut-off值）为196.931 pg/mL（图2），灵敏度为77.4%，特异度为92.0%，ROC曲线下面积（AUC）为0.889（P＜0.001），阳性预测值（PPV）为89.1%，阴性预测值（NPV）为78.9%。以Ang-2单一指标诊断异位妊娠的最佳血清浓度截断值 为14.075 ng/mL（图2），AUC为0.854（P＜0.001）。灵敏度、特异度、PPV、NPV分别为79.2%、80.0%、80.8%、78.4%。VEGF和Ang-2联合诊断异位妊娠时ROC的AUC为0.916（P＜0.001），灵敏度、特异度、PPV、NPV分别为81.1%、92.0%、91.5%、82.1%。VEGF+Ang-2联合诊断的AUC、灵敏度、特异度、PPV和NPV都较VEGF或Ang-2单独诊断时高（见表2），但经统计学检验，联合诊断的AUC值与VEGF或Ang-2单独诊断时的AUC值差异并无统计学意义（VEGFvs联合：P=0.146；Ang-2vs联合：P=0.052）。见图2。

表2 VEGF、Ang-2单独和联合诊断早期异位妊娠的价值（ROC曲线参数）

图2 VEGF、Ang-2单独和联合诊断EP的ROC曲线

3 讨论

目前的数据表明，妊娠6～9周的单胎孕妇的稽留流产率约为2%，其发病因素复杂，涉及胚胎染色体异常、内分泌异常、细胞凋亡异常、子宫胎盘循环障碍、环境因素等多方面。妊娠过程中，从受精卵着床到胎盘形成的每个阶段都与新生血管的生成和丰富的血液供应有着密切的关系。参与血管生成调节的因子众多，其中血管内皮生长因子、血管生成素等在调节血管生成中发挥着重要作用［4，5］。本研究在中国人群中证实了血清VEGF、Ang-1和Ang-2是可以作为预测异位妊娠的潜在生物标志。

成功的妊娠从胚胎着床到胎盘形成过程离不开血管的重塑，即血管新生及其通透性的改变，在众多血管生成因子的参与下，滋养细胞进入母体子宫，侵入子宫螺旋小动脉，建立母体与胎儿之间的血管网，从而实现其营养交换［6］。这一过程中，VEGF-VEGFR、Ang-Tie-2在调节血管生成中发挥着尤为重要的作用，如果这一变化未能按时、充分发生，则会影响胚胎的正常发育，甚至出现流产。

Ang-1可维持胎盘血管的生长，Ang-2为Ang-1的天然竞争拮抗剂，减小血管的稳定性，促进血管重塑，两者共同作用对胎盘有保护作用［7］。Ang-2对血管生成的影响与VEGF有关，Ang-2单独存在时，可抑制新生血管的形成，并促进成熟血管退化；而与VEGF同时存在时，则可使血管保持在可塑状态，促使内皮细胞出芽以形成新的血管分支，促进血管生成和血管重建［8］。在本研究中，我们发现异位妊娠组血HCG（2 096.0 U/L）较正常妊娠组低（6 563.0 U/L），差异有统计学意义（P＜0.05）。Ang-2（11.8 ng/mL）的血清水平对比正常早孕组（16.8 ng/mL）明显降低，差异具有统计学意义（P＜0.05），但Ang-1在两组间的血清浓度差异无统计学意义（P＞0.05）。说明Ang-2可作为异位妊娠诊断的一个辅助性标志物。

VEGF有多种功能，而其最主要的作用发生在血管内皮细胞，高浓度的VEGF与许多生殖过程有关：如卵泡的生长过程、子宫内膜的增生过程已及早孕期妊娠黄体的维持和囊胚着床过程等。在缺氧的条件下VEGF的表达增加，异位妊娠中VEGF的产生和分泌似乎会增高，有研究发现滋养层对管壁的浸润程度越高，VEGF的水平越高［6］。VEGF可作为宫外孕的诊断标志之一。我们研究发现异位妊娠组血VEGF（234.6 pg/mL），明显高于正常妊娠组（77.3 pg/mL），这一结果与VEGF的作用机制相符。

Felemban等［9］将研究对象分为宫内正常妊娠组、胚胎停育组与输卵管妊娠组，比较3组VEGF水平后得出结论，把VEGF水平为200 pg/mL作为鉴别异位妊娠与正常宫内孕的截断值，其灵敏度为88%，特异度为100%。我们的研究中将VEGF的Cut-off值设为大于196.931 pg/mL，诊断为宫外孕的灵敏度为77.4%，特异度为92.0%。结论同Felemban等［9］的报道基本一致。Ang-2的单独Cutoff值设为小于14.075 pg/mL，诊断异位妊娠的敏感性和特异性分别是79.2%和80.0%。而两者联合检测的AUC、灵敏度、特异度、PPV和NPV分别为0.916、81.1%、92.0%、91.5%、82.1%，都 较VEGF或Ang-2单独诊断时高，但经统计学检验比较，联合诊断的AUC值与VEGF或Ang-2单独诊断时的AUC值差异并无统计学意义，未能提高检测效率。我们的研究在中国人群中证实了血清VEGF和Ang-2是可以作为预测异位妊娠的潜在生物标志物，对超声及HCG诊断不明的异位妊娠可以起到辅助诊断的作用。