菊花挥发油对金黄色葡萄球菌抑制作用的研究

韩晓芳，郭彪辉，李丽雪，镇鸿燕，陈 璇

(1.江汉大学 环境与健康学院, 湖北 武汉 430056；2.江汉大学 医学院, 湖北 武汉 430056；3.武汉市城市防洪勘测设计院有限公司，湖北 武汉 430014)

1 引言

本研究所用菊花产自湖北省，具有独特的杀菌、消炎、解毒等作用，可有效减轻烟气对肺部所产生的炎性反应和氧化损伤，暂未发现毒害作用。近年来有关菊花挥发性成分分析的文献较多，但对于菊花挥发油主要成分分析及其抗细菌功效的研究鲜有报道[1～5]。现代药理学研究表明，挥发油、氨基酸类物质、黄酮类化合物，以及其他微量元素是菊花的主要组成成分，使其在药理学中应用广泛，有抵抗细菌、对抗病菌毒素、清热解毒功效[6]。

金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)是兼性厌氧的革兰氏阳性菌，也是医疗感染和食品中最常见的病原体之一，由其引起的食物中毒已成为世界性的公共卫生问题。鉴于菊花成分有效的抑菌作用[7，8]，本研究采用水蒸气蒸馏法提取香菊精油，主要成分为萜烯类、醇类、醛酮类等挥发性成分，探究其对金黄色葡萄球菌的抑菌效果及影响因素，以期为金黄色葡萄球菌的防治提供一定的科学依据。

2 材料与方法

2.1 实验材料

菊花(产自湖北省武汉市)；金黄色葡萄球菌(江汉大学医学院)；甲苯胺蓝核酸琼脂培养基，牛肉膏蛋白胨培养基；Tween-80试剂。

2.2 实验仪器

BD240 型 36℃ 微生物培养箱、KB240 型 28℃ 生化培养箱、AC2-4S1 型生物安全柜(均购自德国Binder)；Sup G6R 型菌落计数/筛选/抑菌圈测量联用仪(新加坡Esco)；雷磁pH计(PHS-3C)：BOXUN 超净工作台(SW-CJ-1F)；分光光度计(721G 可见分光光度计)；快速恒温数显水箱(HH-42)；气质联用仪(美国安捷伦公司 6890GC/5973MSD型)

2.3 研究方法

2.3.1 香菊精油的制备

取15种不同批次的菊花药材，每种批次50 g，加400 mL蒸馏水浸泡3 h,后根据《中国药典》(2010),采用水蒸气蒸馏法提取菊花挥发油[9，10]，将原料放入蒸馏锅，加水浸过料层，加热，连续提取5 h,得到油状物质,冷却放置，密封，储存备用。

2.3.2 提取物抑菌效果的研究

2.3.2.1 试管稀释法测最低抑菌浓度(MIC)

采用二倍稀释法确定最低抑菌浓度。以1∶1体积比向待测样品中加入5‰Tween-80溶液，将稀释好的待测样取出一半倒入新试管，再加入同等体积的5‰Tween-80溶液稀释，依次类推，将原液浓度稀释为原来的1/2，1/4，1/8，1/16等。采用牛津小杯法进行抑菌实验，用同体积的Tween-80溶液作空白对照[11]，24 h后观察。

2.3.2.2 pH值对菊花挥发油抑菌效果影响

制备菌悬液(20环菌种+2 mL盐水)，在最低抑菌浓度(MIC)中培养24 h，测定抑菌活性。

配制普通牛肉膏蛋白胨液体培养基，分成5份，调节pH值分别为5、6、7、8、9，用高压灭菌锅灭菌20 min，不同pH值的液体培养基分别设置完全空白组，金黄色葡萄球菌组，挥发油组，以及金黄色葡萄球菌和挥发油混合组。培养24 h后通过检测试管中培养液的吸光度反映抑菌率。

2.3.2.3 对金黄色葡萄球菌耐热核酸酶的抑制实验

在甲苯胺蓝核酸琼脂上打出10～12个直径约3 mm的小孔(超净工作台中操作)，取10 μL在最低抑菌浓度挥发油条件下培养24 h的菌悬液，接种到小孔中，35 ℃下培养4 h，观察实验结果[12～14]。

2.3.2.4 挥发油成分分析

采用气相色谱-质谱(GC-MS)联用技术对菊花挥发油进行指纹图谱测定[15]，采取国家药监局推广建议的中药指纹图谱软件来计算，生成菊花挥发油的指纹图谱。

3 结果与分析

3.1 最低抑菌浓度(MIC)的确定

3.1.1 最低抑菌浓度的初步确定

由图1可知，经24 h培养后，4个浓度均有抑菌圈出现，且大小相近，应继续用二倍稀释法对原挥发油溶液进行稀释，寻找最低抑菌浓度。

(a)实验组 (b)对照组

3.1.2 最低抑菌浓度的最终确定

采用二倍稀释法将挥发油原液继续稀释到原液浓度的1/8、1/64、1/128、1/256，并设置原液作为阳性对照组，同体积Tween-80水溶液作为阴性对照组(KB组)，相同条件下进行抑菌实验。测量各组抑菌圈生长直径，结果见表1。

表1 二倍稀释法测最低抑菌浓度中不同浓度挥发油抑菌圈直径

实验中KB组没有抑菌圈出现，因此牛津杯直径为7.5 mm,1/256～1/8原液浓度范围内，随着挥发油浓度的减小，抑菌圈直径也逐渐减小，当浓度为原液浓度的1/256时，抑菌圈大小与KB组极为接近，即该浓度为最低抑菌浓度。

3.2 pH值对菊花挥发油抑菌效果影响

本研究采用菌液吸光度反映不同pH值下的抑菌率。相同条件下，吸光度越高，菌液内细菌数量越多，即抑菌效果越差；反之，抑菌效果越好。绘制pH值-吸光度曲线如图2所示。

图2 pH度对吸光度的影响

由图2可知，pH值与菌液吸光度的相关性显著，呈抛物线关系，随着pH值的上升，吸光度先上升后下降，在pH=8附近达到峰值。可据此推断，pH值对挥发油抑菌效果有显著影响。pH=8时抑菌效果最差，pH=5时抑菌效果最好。

3.3 菊花挥发油对金黄色葡萄球菌耐热核酸酶的抑制实验

由图3可知，在对金黄色葡萄球菌耐热核酸酶的抑制实验中，发现无粉红色晕和蓝色圈围绕产生，TNase反应结果呈阴性，表明高浓度菊花挥发油能有效抑制金黄色葡萄球菌的产毒素作用。

图3 金黄色葡萄球菌耐热核酸酶的抑制实验

3.4 挥发油成分分析

3.4.1 气相色谱-质谱(GC-MS)图谱建立

上机GC/MS条件：HP-5MS(30 m×250μm×0.25 μm)毛细管柱；进样口温度：250 ℃；载气及流速：He ，1 mL/min；柱头压：7.6522 psi ；进样量：1 μL；分流比：10∶1；程序升温：40 ℃ (3 min)以5 ℃/min升到150 ℃，再以8 ℃/min升到250 ℃ (5 min)；溶剂延迟：4 min；传输线温度：280 ℃；EI源电子能量：70 eV；离子源温度：230 ℃；四极杆温度：150 ℃；质谱扫描范围：30～400 amu；应用NIST08谱库进行检索[16]。结果如图4所示。

图4 菊花挥发油GC-MS指纹图谱共有模式

所有组分质谱数据经计算机处理和标准质谱图库检索鉴定后,可初步确定菊花挥发性成分中的化合物，计算菊花挥发油的指纹图谱，总共形成114个峰，选取其中分离的最好并且最为平稳的84号峰(三甲基-2-vinylbicyclo1，7,HEPT-)作为参照，其余42个峰的相对保留时间可以由此得出[17]。这43个峰的面积总和占总峰面积的绝大部分，大于70%。

3.4.2 菊花挥发油质谱分析结果

搜索标准的质谱图库NIST08，同时整合大量数据，辨析了菊花挥发油指纹图谱中的共有峰成分，求出每个峰的相对保留值，结果见表2。

表2 菊花挥发油指纹图谱中的共有峰成分分析

续表2

神农香菊挥发油图谱的成分分析显示，菊花挥发油中主要有43种化合物，其中苯类、烃类、烯类以及醇类物质占大部分，还包含酸类和烯类氧化物。推测挥发油中起抑菌作用的物质可能是其中的萜烯类、醇类、醛酮类等挥发性成分，但是也无法确定具体的物质[18]。

4 结论

菊花挥发油对金黄色葡萄球菌具有一定的抑制作用，是比较理想的金黄色葡萄球菌抑制剂。通过二倍稀释法得出：最低抑菌浓度为挥发油原液浓度的1/256；通过pH值对菊花挥发油抑菌效果的影响实验得出：pH值值与挥发油抑菌效果有较为显著的曲线关系，pH=8时，抑菌效果最差，pH=5时，抑菌效果最好；耐热核酸酶抑制试验的结果表明：挥发油能有效抑制金黄色葡萄球菌的产毒作用。此外，本研究利用气相色谱-质谱(GC-MS)联用技术对菊花挥发油主要成分进行分析，推测起抑菌作用的可能是其中的萜烯类、醇类、醛酮类等物质，但确定菊花挥发油中抑菌物质的具体成分，还有待后续进一步研究。