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HPLC波长切换法测定不同产地紫菀中芹菜素、槲皮素和紫菀酮的含量

2022-08-11时向利

化工设计通讯 2022年7期
关键词:紫菀槲皮素产地

时向利,朱 倩

(1.江苏康缘医药商业有限公司,江苏连云港 222000;2.江苏康缘药业股份有限公司,江苏连云港 222000)

紫菀为菊科植物紫菀Aster tataricus L.f.的干燥根和根茎,具有润肺下气、消痰止咳之功效,用于痰多喘咳、新久咳嗽、劳嗽咳血[1]。紫菀为许多常用中药复方制剂的处方药味之一,2020年版《中国药典》收载的含紫菀的中药复方制剂有二十余个,如止咳宝片、蛤蚧定喘丸、小儿肺咳颗粒和二母安嗽丸等,临床上广泛用于治疗哮喘、咳嗽和肺癌等疾病的治疗[2-4]。紫菀中主要含有三萜类、蒽醌类、黄酮类、有机酸及酚类化学成分[5-6],紫菀含量测定方面的文献报道有紫菀酮的含量测定[7]、黄酮类、有机酸类和香豆素类成分的含量测定[8],未见同时测定三萜类成分和黄酮类成分的含量方法报道。本文以紫菀中特有的三萜类化学成分紫菀酮和黄酮类成分芹菜素、槲皮素为对象,采用波长切换的方法建立同时测定紫菀中芹菜素、槲皮素和紫菀酮含量的方法,研究不同产地紫菀中3种成分的含量,为完善紫菀质量控制方法提供依据。

1 仪器和试剂

Agilent 1260高效液相色谱仪,DAD 检测器;梅特勒MS105DU 型电子分析天平;德意生040S 型超声波清洗机。

芹菜素(批号111901-202004,含量以99.4%计)、槲皮素(批号100081-201610,含量以99.1%计)和紫菀酮(批号111581-201806,含量以99.4%计),中国食品药品检定研究院。乙腈、磷酸为色谱纯,水为娃哈哈纯净水,甲醇为分析纯。

28批紫菀药材产地为河北、安徽、陕西、四川等地,具体信息如下:样品S1、S2、S3、S4、S5、S6、S7,产地为河北安国;样品S8,产地为河北定州;样品S9、S10,产地为河北祁州;样品S11、S12、S13、S14、S15、S16、S17,产地为安徽亳州;样品S18、S19,产地为安徽六安;样品S20,产地为四川康定;样品S21、S22,产地为四川德阳;样品S23,产地为四川绵阳;样品S24、S25,产地为陕西西安;样品S26,产地为湖北蕲春;样品S27,产地为湖北蕲春;样品S28,产地为湖北宜昌。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱:Agilent ZORBAX SB-C18(4.6×250mm,5μm);流动相:乙腈-0.1% 磷酸溶液;梯度洗脱,0~5min:15% 乙 腈;5~22min:15% →32% 乙腈;22~30min:32% →96% 乙 腈;30~55min:96%乙腈;柱温:40 ℃;流速:1.0mL/min;检测波长:0~30min 设为360nm(测定槲皮素和芹菜素),30~55min 设为200nm(测定紫菀酮);进样量为10μL。见图1。

图1 HPLC色谱图

2.2 溶液配制

混合对照品溶液:取芹菜素、槲皮素和紫菀酮对照品,精密称定,加甲醇配制成混合对照品溶液,其中芹菜素、槲皮素和紫菀酮的浓度分别为50μg/mL、80μg/mL 和80μg/mL。

供试品溶液:取紫菀药材粉末约2g,精密称定,转移至带塞的三角瓶中,精密量取甲醇50mL 加入三角瓶中,称重,浸泡2h,超声处理50min,放冷后再次称重,用甲醇补重,摇匀,静置,取上清液离心,即得。

2.3 精密度试验

取2.2项下混合对照品溶液进样分析,连续进样6针。计算6针进样色谱图中芹菜素、槲皮素和紫菀酮的峰面积RSD,结果分别为0.98%、0.84%和1.20%,表明仪器精密度良好。

2.4 线性关系的考察

分别称取芹菜素、槲皮素和紫菀酮对照品13.25mg、17.89mg 和20.25mg,置于100mL 容量瓶内,加甲醇使溶解后稀释至刻度,记为X1溶液;将X1溶液用甲醇逐倍稀释得X2、X3、X4和X5溶液。分别精密吸取X 5、X 4、X 3、X 2和X 1溶液各10μL进样测定。用峰面积对浓度(μg/mL)进行线性回归。结果如下。

芹菜素:回归方程Y=15.0101X+11.7500,r=0.9999,线性范围(μg/mL):8.23~131.71。槲皮素:回归方程Y=17.6951X+20.7500,r=0.9998,线性范围(μg/mL):11.08~177.29。紫菀酮:回归方程Y=7.1732X+3.7083,r=1.0000,线性范围(μg/mL):12.58~201.29。

2.5 稳定性试验

取编号为S1的紫菀药材粉末,制备一份供试品溶液,于室温条件下放置0、4、8、12、16和24h 时,进样分析。计算6个时间点所得图谱中芹菜素、槲皮素和紫菀酮峰面积的RSD,结果分别为1.96%、1.52%和1.88%,表明在室温条件下供试品溶液放置24h 稳定。

2.6 重复性试验

取编号为S1的紫菀药材粉末6份,按2.2项下方法制备供试品溶液,进样分析,计算每份样品中芹菜素、槲皮素和紫菀酮的含量和6 份样品的平均含量。结果6份供试品中,芹菜素、槲皮素和紫菀酮的平均含量分别为1.42mg/g(RSD=1.63%)、1.74mg/g(RSD=1.48%)和2.09mg/g(RSD=2.02%)。

2.7 回收率试验

取编号为S1的紫菀药材粉末,称取9份,每份取约1g,精密称定,分成3组,每组3份,分别加入相当于样品含量50%、100%和150%的混合对照品母液(混合对照品母液中芹菜素、槲皮素和紫菀酮浓度分别为0.716 7mg/mL、0.907 8mg/mL 和1.075 2mg/mL,每组加入体积分别为1.0mL、2.0mL 和3.0mL),按2.2项下方法制备供试品溶液,进样分析,记录色谱图,计算结果。芹菜素、槲皮素和紫菀酮含量的回收率结果见表1。

表1 加样回收率结果(n=9)

2.8 样品测定

取表1中28批紫菀药材粉末进行测定,计算28批紫菀中芹菜素、槲皮素和紫菀酮3种成分的含量,结果见表2。

表2 紫菀中3种成分的含量(单位:%,n=2)

从表4,芹菜素、槲皮素和紫菀酮的含量分别为0.06%~0.21%、0.12%~0.28%、0.09%~0.41%。28 批紫菀药材中有3批样品紫菀酮含量未达到2020年版《中国药典》要求,紫菀酮含量最高的是安徽和四川两省的紫菀药材。从芹菜素、槲皮素和紫菀酮3种成分的均一程度来分析,剔除紫菀酮含量不符合要求的3批次样品后,均一性最好的为紫菀的道地产区河北(河北省9批次紫菀中3种指标成分含量的RSD 均不大于20%),其次为作为主要种植地的安徽。

3 讨论

采用全波长扫描方式,采集芹菜素、槲皮素和紫菀酮在190~400nm 的吸收光谱,结果芹菜素和槲皮素360nm 有最大吸收,紫菀酮为一种三萜类化合物,分子骨架中无共轭基团,只有紫外末端吸收。为了使3种成分均能较好地检出,测定时选择波长切换的方法,设定360nm 测定槲皮素和芹菜素的含量、200nm测定紫菀酮的含量。

以紫菀药材中芹菜素、槲皮素和紫菀酮的提取率为考察对象,对是否浸泡、浸泡时间、提取方式和提取溶剂进行考察,结果在提取前先浸泡2h 提取效果较好,回流提取和超声提取两种方式提取效率相当,因此选择操作简便的超声提取;甲醇作为提取溶剂的效果优于乙醇,故选择甲醇作为提取溶剂。

本文建立了波长切换的方法同时测定不同产地紫菀中芹菜素、槲皮素和紫菀酮的含量,并进行了完整的方法学验证。从测定的28批紫菀药材芹菜素、槲皮素和紫菀酮的含量可知,剔除紫菀酮含量不符合要求的3批次样品后,紫菀的地道产区河北和主要种植地安徽均一性优于其他产地,不同产地的紫菀药材可能受生长环境和采收季节的影响,存在良莠不齐的现象,甚至还有不符合2020年版《中国药典》要求的药材,应引起重视。

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