HPLC波长切换法测定不同产地紫菀中芹菜素、槲皮素和紫菀酮的含量

时向利，朱 倩

（1.江苏康缘医药商业有限公司，江苏连云港 222000；2.江苏康缘药业股份有限公司，江苏连云港 222000）

紫菀为菊科植物紫菀Aster tataricus L.f.的干燥根和根茎，具有润肺下气、消痰止咳之功效，用于痰多喘咳、新久咳嗽、劳嗽咳血[1]。紫菀为许多常用中药复方制剂的处方药味之一，2020年版《中国药典》收载的含紫菀的中药复方制剂有二十余个，如止咳宝片、蛤蚧定喘丸、小儿肺咳颗粒和二母安嗽丸等，临床上广泛用于治疗哮喘、咳嗽和肺癌等疾病的治疗[2-4]。紫菀中主要含有三萜类、蒽醌类、黄酮类、有机酸及酚类化学成分[5-6]，紫菀含量测定方面的文献报道有紫菀酮的含量测定[7]、黄酮类、有机酸类和香豆素类成分的含量测定[8]，未见同时测定三萜类成分和黄酮类成分的含量方法报道。本文以紫菀中特有的三萜类化学成分紫菀酮和黄酮类成分芹菜素、槲皮素为对象，采用波长切换的方法建立同时测定紫菀中芹菜素、槲皮素和紫菀酮含量的方法，研究不同产地紫菀中3种成分的含量，为完善紫菀质量控制方法提供依据。

1 仪器和试剂

Agilent 1260高效液相色谱仪，DAD 检测器；梅特勒MS105DU 型电子分析天平；德意生040S 型超声波清洗机。

芹菜素（批号111901-202004，含量以99.4%计）、槲皮素（批号100081-201610，含量以99.1%计）和紫菀酮（批号111581-201806，含量以99.4%计），中国食品药品检定研究院。乙腈、磷酸为色谱纯，水为娃哈哈纯净水，甲醇为分析纯。

28批紫菀药材产地为河北、安徽、陕西、四川等地，具体信息如下：样品S1、S2、S3、S4、S5、S6、S7，产地为河北安国；样品S8，产地为河北定州；样品S9、S10，产地为河北祁州；样品S11、S12、S13、S14、S15、S16、S17，产地为安徽亳州；样品S18、S19，产地为安徽六安；样品S20，产地为四川康定；样品S21、S22，产地为四川德阳；样品S23，产地为四川绵阳；样品S24、S25，产地为陕西西安；样品S26，产地为湖北蕲春；样品S27，产地为湖北蕲春；样品S28，产地为湖北宜昌。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Agilent ZORBAX SB-C18（4.6×250mm，5μm）；流动相：乙腈-0.1% 磷酸溶液；梯度洗脱，0～5min：15% 乙 腈；5～22min：15% →32% 乙腈；22～30min：32% →96% 乙 腈；30～55min：96%乙腈；柱温：40 ℃；流速：1.0mL/min；检测波长：0～30min 设为360nm（测定槲皮素和芹菜素），30～55min 设为200nm（测定紫菀酮）；进样量为10μL。见图1。

图1 HPLC色谱图

2.2 溶液配制

混合对照品溶液：取芹菜素、槲皮素和紫菀酮对照品，精密称定，加甲醇配制成混合对照品溶液，其中芹菜素、槲皮素和紫菀酮的浓度分别为50μg/mL、80μg/mL 和80μg/mL。

供试品溶液：取紫菀药材粉末约2g，精密称定，转移至带塞的三角瓶中，精密量取甲醇50mL 加入三角瓶中，称重，浸泡2h，超声处理50min，放冷后再次称重，用甲醇补重，摇匀，静置，取上清液离心，即得。

2.3 精密度试验

取2.2项下混合对照品溶液进样分析，连续进样6针。计算6针进样色谱图中芹菜素、槲皮素和紫菀酮的峰面积RSD，结果分别为0.98%、0.84%和1.20%，表明仪器精密度良好。

2.4 线性关系的考察

分别称取芹菜素、槲皮素和紫菀酮对照品13.25mg、17.89mg 和20.25mg，置于100mL 容量瓶内，加甲醇使溶解后稀释至刻度，记为X1溶液；将X1溶液用甲醇逐倍稀释得X2、X3、X4和X5溶液。分别精密吸取X 5、X 4、X 3、X 2和X 1溶液各10μL进样测定。用峰面积对浓度（μg/mL）进行线性回归。结果如下。

芹菜素：回归方程Y=15.0101X+11.7500，r=0.9999，线性范围（μg/mL）：8.23～131.71。槲皮素：回归方程Y=17.6951X+20.7500，r=0.9998，线性范围（μg/mL）：11.08～177.29。紫菀酮：回归方程Y=7.1732X+3.7083，r=1.0000，线性范围（μg/mL）：12.58～201.29。

2.5 稳定性试验

取编号为S1的紫菀药材粉末，制备一份供试品溶液，于室温条件下放置0、4、8、12、16和24h 时，进样分析。计算6个时间点所得图谱中芹菜素、槲皮素和紫菀酮峰面积的RSD，结果分别为1.96%、1.52%和1.88%，表明在室温条件下供试品溶液放置24h 稳定。

2.6 重复性试验

取编号为S1的紫菀药材粉末6份，按2.2项下方法制备供试品溶液，进样分析，计算每份样品中芹菜素、槲皮素和紫菀酮的含量和6 份样品的平均含量。结果6份供试品中，芹菜素、槲皮素和紫菀酮的平均含量分别为1.42mg/g（RSD=1.63%）、1.74mg/g（RSD=1.48%）和2.09mg/g（RSD=2.02%）。

2.7 回收率试验

取编号为S1的紫菀药材粉末，称取9份，每份取约1g，精密称定，分成3组，每组3份，分别加入相当于样品含量50%、100%和150%的混合对照品母液（混合对照品母液中芹菜素、槲皮素和紫菀酮浓度分别为0.716 7mg/mL、0.907 8mg/mL 和1.075 2mg/mL，每组加入体积分别为1.0mL、2.0mL 和3.0mL），按2.2项下方法制备供试品溶液，进样分析，记录色谱图，计算结果。芹菜素、槲皮素和紫菀酮含量的回收率结果见表1。

表1 加样回收率结果（n=9）

2.8 样品测定

取表1中28批紫菀药材粉末进行测定，计算28批紫菀中芹菜素、槲皮素和紫菀酮3种成分的含量，结果见表2。

表2 紫菀中3种成分的含量（单位：%，n=2）

从表4，芹菜素、槲皮素和紫菀酮的含量分别为0.06%～0.21%、0.12%～0.28%、0.09%～0.41%。28 批紫菀药材中有3批样品紫菀酮含量未达到2020年版《中国药典》要求，紫菀酮含量最高的是安徽和四川两省的紫菀药材。从芹菜素、槲皮素和紫菀酮3种成分的均一程度来分析，剔除紫菀酮含量不符合要求的3批次样品后，均一性最好的为紫菀的道地产区河北（河北省9批次紫菀中3种指标成分含量的RSD 均不大于20%），其次为作为主要种植地的安徽。

3 讨论

采用全波长扫描方式，采集芹菜素、槲皮素和紫菀酮在190～400nm 的吸收光谱，结果芹菜素和槲皮素360nm 有最大吸收，紫菀酮为一种三萜类化合物，分子骨架中无共轭基团，只有紫外末端吸收。为了使3种成分均能较好地检出，测定时选择波长切换的方法，设定360nm 测定槲皮素和芹菜素的含量、200nm测定紫菀酮的含量。

以紫菀药材中芹菜素、槲皮素和紫菀酮的提取率为考察对象，对是否浸泡、浸泡时间、提取方式和提取溶剂进行考察，结果在提取前先浸泡2h 提取效果较好，回流提取和超声提取两种方式提取效率相当，因此选择操作简便的超声提取；甲醇作为提取溶剂的效果优于乙醇，故选择甲醇作为提取溶剂。

本文建立了波长切换的方法同时测定不同产地紫菀中芹菜素、槲皮素和紫菀酮的含量，并进行了完整的方法学验证。从测定的28批紫菀药材芹菜素、槲皮素和紫菀酮的含量可知，剔除紫菀酮含量不符合要求的3批次样品后，紫菀的地道产区河北和主要种植地安徽均一性优于其他产地，不同产地的紫菀药材可能受生长环境和采收季节的影响，存在良莠不齐的现象，甚至还有不符合2020年版《中国药典》要求的药材，应引起重视。