滋水涵木利胆方对肝肾亏虚型原发性胆汁性胆管炎患者外周血辅助性T淋巴细胞17及相关细胞因子的影响※

黄 祎 许国圣 杨浦娟 胡文艳 李 梅 刘华宝

(重庆市中医院肝病科，重庆 400021)

原发性胆汁性胆管炎(primary biliary cholangitis,PBC)是一种自身免疫性肝病，临床症状以胆汁淤积为主，病理表现主要为肝内小叶间胆管慢性非化脓性炎症和肉芽肿性破坏，病情逐渐发展，导致肝硬化，最终可出现肝衰竭等[1]。PBC发病率为3～15/10万人，并有逐年上升趋势[2-3]。PBC的发病机制十分复杂，目前普遍认为是由免疫网络失衡而致胆管上皮细胞损伤，最终导致胆汁淤积和肝纤维化[4]，其中辅助性T淋巴细胞17(Th17)及相关细胞因子的异常免疫反应在PBC发病中的作用也多有研究。前期研究已证实，滋水涵木利胆方治疗PBC取得较好的临床疗效[5]。2017年1月至2018年9月，我们采用滋水涵木利胆方联合熊去氧胆酸胶囊治疗肝肾亏虚型PBC 38例，并与熊去氧胆酸胶囊治疗38例对照，观察对中医证候、Th17及相关细胞因子的影响，结果如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 全部76例均为重庆市中医院肝病科门诊PBC患者，按照随机数字表法分为2组。治疗组38例(后脱落1例)，男5例，女32例；年龄35～70岁，平均(58.00±8.18)岁；病程1～13年，平均(5.60±3.03)年。对照组38例(后脱落2例)，男3例，女33例；年龄37～69岁，平均(59.89±7.97)岁；病程1～11年，平均(5.17±2.50)年。2组一般资料比较差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。同时纳入重庆市中医院体检中心30名健康志愿者为健康组，男2名，女28名；年龄33～70岁，平均(56.87±8.26)岁。入组的2组PBC患者与健康组之间年龄、性别比较差异无统计学意义(P>0.05)。

1.2 病例选择

1.2.1 西医诊断标准 参照《原发性胆汁性肝硬化(又名原发性胆汁性胆管炎)诊断和治疗共识(2015)》[6]：①无其他原因解释的血清碱性磷酸酶(ALP)、γ-谷氨酰转移酶(GGT)升高，并且免疫学检查提示抗线粒体抗体(AMA)(滴度>1∶40)和(或)抗线粒体2型抗体(AMA-M2)阳性的成年患者；②对于免疫学检查AMA和AMA-M2阴性，可通过肝穿刺病理活检确诊。

1.2.2 中医辨证标准 参照《中医内科常见病诊疗指南：西医疾病部分》[7]中“胆汁淤积性肝病”的标准，参照《中药新药临床研究指导原则(试行)》[8]辨证为肝肾亏虚型。主症:皮肤瘙痒，乏力，黄疸，胁痛。次症:情志抑郁，口干，眼干，大便稀溏，纳差，腹胀，失眠。舌脉:舌质红，无苔或少苔，脉细数。满足2项主症，2项或超过2项的次症，同时符合舌脉，即可确诊。

1.2.3 纳入标准 符合以上西医诊断标准及中医辨证标准;血清ALP≥220 U/L，GGT≥100 U/L；有良好的依从性，能按时服药，按规定时间复查者；年龄18～70岁；患者知情同意，自愿接受该项试验。健康组志愿者选择标准如下：年龄18～70岁，否认既往有自身免疫性疾病;近4周没有接受过免疫抑制剂等治疗;未患精神障碍、重度各系统病变、免疫缺陷、恶性肿瘤。本研究得到重庆市中医院医学伦理委员会批准，批件号：2017-ky-5。

1.2.4 排除标准 ①排除病毒性、遗传代谢性、血吸虫性、药物酒精性等其他原因所致的肝病;②对所用药物有过敏或不良反应者;③同时在服用与本病有关的免疫调节剂，如糖皮质激素、甲氨蝶呤者;④合并有肿瘤、肝硬化失代偿期严重并发症者;⑤有严重心脏或肾、脑、肺及造血系统疾病者;⑥妊娠期或哺乳期妇女。

1.3 治疗方法

1.3.1 对照组 予熊去氧胆酸胶囊(Losan Pharma GmbH，国药准字H20181059)250 mg，每日3次口服。

1.3.2 治疗组 在对照组治疗基础上予滋水涵木利胆方治疗。药物组成：熟地黄、黄精、陈皮各10 g，秦艽、葛根、白芍、鸡内金各30 g，金钱草、徐长卿、山茱萸各15 g。日1剂，采用北京康仁堂药业有限公司生产的颗粒剂，每日3次餐后30 min冲服。

1.3.3 疗程 2组均治疗24周。

1.4 观察指标及方法

1.4.1 中医证候评分 参照《中药新药临床研究指导原则(试行)》[8]。主症:皮肤瘙痒、乏力、黄疸、胁痛，按程度无、轻、中、重度分别记0、2、4、6分。次症:情志抑郁、口干、眼干、大便稀溏、纳差、腹胀、失眠，按程度无、轻、中、重度分别记0、1、2、3分。

1.4.2 Th17检测 健康组于采血当日清晨空腹抽肘静脉血，治疗组、对照组均于治疗前后清晨空腹采集肘静脉血。采用流式细胞术检测外周血Th17表达率。使用Accuri C6流式细胞仪(美国BD公司)，严格按照说明书进行操作，完成细胞的收集，用0.5 mL磷酸盐缓冲液(PBS)吹散细胞后上机，采用BD FACSDiva软件分析数据，得出Th17的表达率。

1.4.3 血清细胞因子检测 健康组于采血当日清晨空腹抽肘静脉血，治疗组、对照组均于治疗前后清晨空腹采集肘静脉血。采用酶联免疫吸附法(ELISA)检测血清白细胞介素(IL)-6、IL-17、IL-21、IL-23、转化生长因子β1(TGF-β1)水平，试剂盒购自杭州联科生物技术有限公司。

1.4.4 相关性分析 采用Spearman相关性分析对治疗组和对照组中医证候评分、外周血Th17和相关细胞因子的相关性进行分析。

2 结果

2.1 2组治疗前后中医证候评分比较 治疗组治疗后除情志抑郁、纳差评分外，其余中医证候各项评分及总分均较本组治疗前降低(P<0.05)，对照组治疗后除情志抑郁、腹胀评分外均降低(P<0.05)，且治疗组治疗后黄疸、胁痛、口干、眼干、腹胀评分及总分均低于对照组(P<0.05)。见表1。

表1 2组治疗前后中医证候评分比较 分，

2.2 3组Th17表达率比较 与健康组比较，2组PBC患者治疗前外周血Th17表达率均升高(P<0.05)。2组治疗后Th17表达率均较本组治疗前降低(P<0.05)，且治疗组治疗后低于对照组(P<0.05)。见表2，图1。

表2 3组Th17表达率比较

健康组 治疗组 对照组

2.3 3组血清IL-17、IL-6、IL-21、IL-23、TGF-β1水平比较 与健康组比较，2组PBC患者治疗前IL-17、IL-6、IL-21、IL-23水平均升高(P<0.05)，TGF-β1水平均降低(P<0.05)。2组治疗后IL-17、IL-6、IL-21、IL-23水平均较本组治疗降低(P<0.05)，TGF-β1水平均升高(P<0.05)，且治疗组治疗后IL-17、IL-6水平均低于对照组(P<0.05)，2组治疗后IL-21、IL-23、TGF-β1水平比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表3。

表3 3组血清IL-17、IL-6、IL-21、IL-23、TGF-β1水平比较

2.4 相关性分析

2.4.1 PBC患者Th17表达率与相关细胞因子间的相关性 PBC患者Th17表达率与IL-6、IL-17呈正相关。见图2。

图2 PBC患者外周血Th17与IL-6、IL-17相关性分析散点图

2.4.2 PBC患者外周血Th17、相关细胞因子水平与中医证候评分间的相关性 PBC患者Th17外周血表达与中医证候评分不存在明显相关性。PBC患者血清IL-6、IL-17、IL-21水平与中医证候评分呈正相关。见图3。

图3 PBC患者外周血Th17、相关细胞因子含量与中医证候评分相关性分析散点图

2.4.3 PBC患者相关细胞因子之间的相关性 PBC患者血清IL-6与IL-17、IL-6与IL-21、IL-17与IL-21呈正相关。见图4。

图4 PBC患者外周血Th17相关细胞因子之间相关性分析散点图

3 讨论

PBC是一种自身免疫性肝病，临床症状以胆汁淤积为主，病理表现主要为肝内小叶间胆管慢性非化脓性炎症和肉芽肿性破坏，病情逐渐发展，导致肝硬化，最终可出现肝衰竭等[1]。在复杂的PBC发病机制中，“上游”异常免疫反应和“下游”炎症损伤是PBC病情进展的两大核心环节，而Th17与相关细胞因子表达异常发挥着非常关键的作用。目前PBC临床用药为熊去氧胆酸和奥贝胆酸。奥贝胆酸在国内尚未上市，而熊去氧胆酸有效延缓疾病进展的比率大约为 60%，仍有约40%的PBC患者病情不能得到有效缓解[2]。因此，发挥中医药优势治疗PBC至关重要。我们前期通过临床研究肯定了滋水涵木利胆方联合熊去氧胆酸在改善PBC患者症状及生化指标方面较单用熊去氧胆酸有显著优势[5]。本研究从Th17及相关细胞因子角度，探讨滋水涵木利胆方治疗PBC患者的可能发病机制。

PBC好发于围绝经期女性,此年龄段的女性天癸竭，肾精大亏，水不涵木，又因肝之余气积聚而成胆汁，肝肾阴虚，致肝脏分泌胆汁的能力不足，可兼夹湿、热、瘀等病邪蕴结肝胆,肝脏疏泄功能失常，胆道不利，胆汁的排泄受到影响，终致胆汁不循常道,肝胆络脉阻滞,而肝肾阴虚，精血不足，不能濡养皮肤，水不涵木则木燥而生风，风动则痒。治疗原则为滋水涵木，利胆祛风。滋水涵木利胆方是在PBC的中医病机分析基础上拟定的，方中熟地黄、山茱萸、黄精养阴益肾；白芍平抑肝阳，养血敛阴，葛根生津止渴，升阳止泻，与白芍配伍，可以制约白芍性寒，防脾胃虚弱者易致泄泻之弊；陈皮行气健脾，调中开胃，防养阴血之药壅滞脾土；鸡内金健胃消食利胆，兼顾温和化瘀；金钱草利胆退黄；徐长卿活血祛风止痒；秦艽祛风通络。全方以补虚治本为主，利胆祛风为辅，共奏滋水涵木、利胆祛风之功。本研究结果显示，2组治疗后中医证候总分均较本组治疗前降低(P<0.05)，且治疗组治疗后低于对照组(P<0.05)。提示滋水涵木利胆方能改善肝肾亏虚型PBC患者中医临床证候。

Rong G等[9]研究结果显示，PBC患者外周血调节性T淋巴细胞(Treg)大幅减少，Th17则大幅增多。Qian C等[10]的研究发现，PBC患者血清IL-17水平和肝组织中IL-17阳性细胞表达明显上调，IL-17可通过激活肝星状细胞和骨髓树突状细胞促进肝硬化的形成[11]。人IL-6对T0细胞分化为Th17并发育成熟起促进作用，其所分泌的细胞因子可进一步促进炎症发生[12-13]，Th17生成的IL-21对Th17分化具正向刺激效能[14]，而其分泌的IL-23也能维持和扩大Th17的分化[15]。TGF-β1在高浓度下促进Treg分化，同时，在低浓度下是可以诱导Th17的分化，这种浓度的差异使TGF-β1对免疫反应具有双向调节作用[16-18]。本研究结果显示，2组治疗后Th17表达率均较本组治疗前降低(P<0.05)，且治疗组治疗后低于对照组(P<0.05)。2组治疗后IL-17、IL-6、IL-21、IL-23水平均较本组治疗降低(P<0.05)，TGF-β1水平均升高(P<0.05)，且治疗组治疗后IL-17、IL-6水平均低于对照组(P<0.05)。经相关性分析可知，PBC患者外周血Th17表达率与IL-17、IL-6呈正相关，中医证候评分与IL-6、IL-17、IL-21呈正相关，IL-6与IL-17、IL-6与IL-21、IL-17与IL-21呈较强的正相关性。由此可推测，IL-6协同TGF-β1打破Th17/Treg细胞平衡，促进Th17分化，其分泌的细胞因子可进一步促进炎性反应，结果与目前大多数研究结果[19-21]相似，但国内存在一项与之不同的结果，陈颖等[22]研究认为，Th17表达与IL-17没有相关性。这些免疫细胞及细胞因子之间是否存在其他的相关性仍需要在深入研究中进一步判断，PBC患者慢性炎症状态中的免疫损伤过程仍需进一步验证。

综上所述，滋水涵木利胆方治疗肝肾亏虚型PBC能改善患者中医临床证候，降低Th17表达率和相关细胞因子水平，推测滋水涵木利胆方可能通过下调IL-6，减少其与TGF-β1的协同作用，抑制Th17表达，削弱相关细胞因子(主要为IL-17)的生成，从而达到抑制下游炎性反应的目的。