沼泽红假单胞菌发酵提高黄芪多糖含量的条件优化

李保珍，刘 琪，樊金华，赵夏婷，贾 璐，杨琬芳

(1.山西中医药大学基础医学院，山西 晋中 030619；2.山西农业大学林学院，山西 太谷 030801)

黄芪是临床上最常用的补中益气药之一，其主要的有效成分为黄芪皂苷、黄芪多糖、黄酮类物质和蛋白质等，其中黄芪多糖是黄芪的水溶性主要成分之一，具有免疫调节[1]，抗肿瘤、抗动脉硬化[2]、抗氧化[3]、降血糖[4]、抗病毒[5]和治疗代谢性紊乱等作用[6]。近年来，随着人民对中医药认知度的逐年提高，黄芪用量也随之增加，传统利用方式已不能满足需求。为了提高黄芪的利用率，许多新技术应运而生。其中，微生物发酵技术能够使黄芪等中药活性成分充分释放，起到增强药效、节省药材资源和维护生态环境等效应，成为研究热点[7]。然而，微生物发酵黄芪还存在作用机理不明确、优良菌种少和发酵工艺难以控制等问题。因此，筛选能够高效提高黄芪有效成分的优良菌种并对其发酵工艺进行优化，大幅减少成本的同时还增加药效，仍是急需解决的难题。

沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonaspalustris,R.palustris)属于紫色非硫菌群，是地球上已发现的最古老的微生物之一，在黑暗好氧或光照厌氧条件下都可正常生长，现已广泛应用于农业、畜禽、渔业、环保和医药保健等领域[8-10]。本文以实验室保藏的一株沼泽红假单胞菌N菌株为发酵黄芪菌株进行液体发酵来提高黄芪多糖的含量，为黄芪的高效利用提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 沼泽红假单胞菌(R.palustris)N菌株[11]由山西大学生命科学学院光合细菌研究室赠予并保藏。

1.1.2 试剂与仪器 黄芪购自榆林市广济堂中药开发有限责任公司(产地内蒙古)；苯酚、浓硫酸、葡萄糖、无水乙醇等试剂均为分析纯；BioTek酶标仪(BioTek Instruments，Inc)；HPX-9052MBE电热恒温培养箱(上海博迅实业有限公司医疗设备厂)；湘立TGL16M离心机(湖南湘立科学仪器有限公司)；雷磁PHS-25型数显pH计(上海仪电科学仪器股份有限公司)；BSD-TX345台式恒温振荡器(上海博迅实业有限公司医疗设备厂)；电热恒温水箱600型(北京中兴伟业世纪仪器有限公司)；LFP-800T高速多功能粉碎机(莱芙)等。

1.2 方法

1.2.1 沼泽红假单胞菌发酵黄芪 采用RCVBN培养基[12]进行黄芪发酵。将黄芪粉碎过40目后按照1∶15的料液比制备培养基，121 ℃灭菌20 min，在菌种接种量为10%、发酵温度为30 ℃、初始培养基pH值为7.0和光照强度为1500 Lux条件下发酵培养。

1.2.2 黄芪多糖的提取与测定 标准曲线的制作：标准曲线的绘制参照杨叔萍[13]所述方法，在490 nm处测定吸光度值。以黄芪多糖溶液浓度C(μg/mL)为横坐标，吸光度值A为纵坐标进行线性回归，得回归方程式为y=0.0312x+0.00066，相关系数为R2=0.9977。

黄芪多糖的提取：取黄芪发酵液20 mL置于振荡器上，300 rpm/min振荡1 h，4000 rpm离心10 min，弃沉淀，向上清中加入3倍体积的无水乙醇，置于4 ℃中过夜，离心收集沉淀，沉淀加水后于70 ℃进行水浴，溶解并定容至50 mL容量瓶中，用于多糖含量的测定[13, 14]。

黄芪多糖含量的测定：参照上述标准曲线绘制所述方法进行吸光度值测定，代入回归方程计算其含量。

1.2.3 单因素试验

1.2.3.1 发酵时间对黄芪多糖含量的影响 在菌种接种量10%，初始培养基pH值7.0和发酵温度30 ℃的条件下，将发酵时间分别设计为3、4、5、6 d，考察发酵时间对黄芪多糖含量的影响。

1.2.3.2 初始培养基pH值对黄芪多糖含量的影响 在菌种接种量10%，发酵时间6 d和发酵温度30 ℃的条件下，将初始培养基pH值分别设计为6.2，6.6，7.0，7.4，考察初始培养基pH对黄芪多糖含量的影响。

1.2.3.3 菌种接种量对黄芪多糖含量的影响 在初始培养基pH值为7.0，发酵温度30 ℃，发酵时间6 d的条件下，将菌种接种量分别设计为6%，8%，10%，12%，考察菌种接种量对黄芪多糖含量的影响。

1.2.3.4 发酵温度对黄芪多糖含量的影响 在菌种接种量为10%，初始培养基pH值为7.0和发酵时间6 d的条件下，将发酵温度分别设计为25 ℃，30 ℃，35 ℃，40 ℃，然后进行发酵温度对黄芪多糖含量的影响。

1.2.4 正交试验设计 根据单因素试验结果，选择发酵时间、菌种接种量、发酵温度和初始培养基pH值4个因子，每个因子在三水平下，以黄芪多糖的含量为指标考察沼泽红假单胞菌发酵对黄芪多糖含量的影响，进行正交试验并进行方差分析。因素水平设计见表1。

表1 正交设计因素水平表

1.2.5 数据统计分析 试验数据以Excel 2019软件整理数据和Origin 8.5作图，同时采用 SPSS 17.0 软件进行统计分析，采用one-way ANOVA进行差异显著性分析，每组试验重复三次。

2 结果与分析

2.1 发酵时间对黄芪多糖含量的影响 发酵时间对黄芪多糖含量的影响见图1。由图1可知，发酵时间对黄芪多糖含量的影响较大，当发酵时间为3-5 d时，黄芪多糖含量随着发酵时间的延长而显著增加(P<0.05)，在5 d时达到最大。发酵时间是影响微生物发酵结果的重要因素，发酵时间短，产生相应酶量相对较少，影响黄芪多糖释放；然而发酵时间过长，培养基所能提供的养分不足，有可能会使产酶的性能下降，影响黄芪多糖产量。同时，随着发酵时间延长，培养基中适宜于沼泽红假单胞菌利用的碳源基本耗尽，此时沼泽红假单胞菌具有将难降解的多糖作为碳源加以利用以维持其正常的生长代谢，这也可能是发酵后期黄芪多糖含量降低的原因之一。因此，发酵时间应控制在5 d左右。

图1 不同发酵时间对黄芪多糖含量的影响

2.2 菌种接种量对黄芪多糖含量的影响 菌种接种量对黄芪多糖含量的影响见图2。如图2所示，当菌种接种量为6%时，黄芪多糖含量最大，之后随着菌种接种量的增加，黄芪多糖含量有一个缓慢下降的趋势。沼泽红假单胞菌的生长受到接种量的影响较大，接种量过低会使发酵周期延长，不利于实际生产。因此，在利用沼泽红假单胞菌发酵黄芪，选择菌种接种量时应控制在6%左右。

图2 不同接种量对黄芪多糖含量的影响

2.3 发酵温度对黄芪多糖含量的影响 发酵温度对黄芪多糖含量的影响如图3所示。由图3可知，发酵温度对黄芪多糖含量的影响较大，随着温度的升高黄芪多糖含量也显著升高(P<0.05)，当温度为40 ℃时黄芪多糖含量达到最大。这种趋势产生的原因可能是高温有利于黄芪多糖的释放，但沼泽红假单胞菌的最适生长温度为30-35 ℃，温度过高的会严重抑制其正常生长代谢。因此，沼泽红假单胞菌发酵黄芪发酵温度不易过高，应该控制在40 ℃以内。

图3 不同发酵温度对黄芪多糖含量的影响

2.4 初始培养基pH值对黄芪多糖含量的影响 初始培养基pH值对黄芪多糖含量的影响见图4。由图4可知，初始培养基pH值对黄芪多糖含量有一定的影响，起初黄芪多糖随着培养基初始pH值的升高而增加，在培养基初始pH值为6.6时黄芪多糖含量达到最大。当培养基初始pH值继续升高，黄芪多糖含量小幅下降，这一趋势与沼泽红假单胞菌的最适生长pH相似。因此，在培养基初始pH值应控制在6.6左右。

图4 不同初始培养基pH值对黄芪多糖含量的影响

2.5 正交试验结果 由表2和表3可知，4个因子中，发酵时间和发酵温度对黄芪发酵液中的黄芪多糖含量产生了极显著性的影响(P<0.01)。根据F值水平将各因子对黄芪多糖含量的影响强弱排序为：发酵时间>发酵温度>菌种接种量>培养基初始pH值。最佳发酵条件为A3B3C3D1，即发酵时间6 d、接种量10%、发酵温度40 ℃和初始培养基pH为6.2，在此条件下，黄芪多糖含量达到了111.40 μg/mL，与对照组相比提高了51.56%。

表2 沼泽红假单胞菌发酵对黄芪多糖含量影响的正交试验结果

表3 沼泽红假单胞菌发酵对黄芪多糖含量影响的方差分析

3 讨论与结论

植物源性中药材的有效成分主要存在于细胞间质包裹的胞浆和植物细胞壁中，而细胞壁是由不同纤维和胶质类物质组成的细胞外结构。因此，在中药提取过程中需要克服多重阻力，才能将胞浆中的有效活性成分释放出来[7]。中药发酵是传统中药加工炮制的重要方法，即以传统中药材为发酵原料，药材中多糖类、苷类、黄酮类等物质可为微生物的生长提供营养，同时微生物在生长代谢过程中分泌大量的蛋白酶、纤维素酶、半纤维素酶、淀粉酶、果胶酶等胞外酶，可使植物细胞破裂，细胞间隙增大，可促进中药中有效成分的溶出，达到提高中药有效成分提取率的目的[15]。陈丽艳等[16]研究结果显示，黄芪经侧耳菌(Pleurotusostreatus)发酵后黄芪多糖的提取率及含量大幅提高，含量增加了71.70%，充分体现了中药发酵可以使黄芪多糖较大限度的释放；郭羽等[17]利用酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)发酵黄芪，结果表明发酵对黄芪中多糖含量有一定影响，其产率与传统法相比提高了14.28%；郭云霞等[10]通过甲基营养型芽胞杆菌(Bacillusmethylotrophic)N-14发酵黄芪后总多糖的含量提高了57.31%。本文利用沼泽红假单胞菌为发酵菌种，以中药黄芪作为培养基的主要成分进行液体发酵取得了相似的结果，在最佳发酵工艺条件下黄芪多糖含量比对照组提高了51.56%。微生物发酵黄芪是经过一系列的酶促反应，会受到发酵菌种、发酵成分及发酵条件等因素的影响。李美洁等[10]报道沼泽红假单胞菌能够分解利用木质素为碳源进行生长，这可能是沼泽红假单胞菌发酵黄芪导致黄芪多糖含量增加的原因之一。

目前报道的中药发酵菌种主要是一些真菌和细菌，对于种类和数量众多的微生物而言，仅为极少部分，因此具有极大的研究开发空间。本文利用实验保藏的一株沼泽红假单胞菌对黄芪进行发酵，能显著提高黄芪多糖的得率，丰富了中药发酵技术的发酵菌种资源。此外，该沼泽红假单胞菌新陈代谢方式多样，可以通过自然界存在的 4 种代谢模式进行生长，包括光合自养、光合异养、化学自养和化学异养[10]。因此，研究将为发酵黄芪的工业化生产提供新的思路。

研究通过沼泽红假单胞菌发酵黄芪，发酵后黄芪多糖较对照组显著提高(P<0.01)。利用正交试验优化了沼泽红假单胞菌发酵黄芪的条件，在最佳发酵条件下即发酵天数6 d，接种量10%，发酵温度40 ℃和初始培养基pH为6.2时，黄芪多糖含量可高达111.40 μg/mL，与对照组相比提高了51.56%。研究结果将为微生物发酵黄芪提供菌种资源以及黄芪的高效利用提供理论支持。