黄芪多糖对小鼠食管癌前病变的影响及机制研究

夏秀丽，赵树山，李 云，宋晓明，徐 珊，程丽敏，李 森，徐 超

(邯郸市中心医院，河北 邯郸 056001)

食管癌是全球范围内较常见的恶性肿瘤之一，约占癌症患者的3.2%，我国为食管癌高发地区[1-2]。食管癌在中医属于“噎膈”范畴，忧思暴怒、瘀血顽痰、气机郁滞是其主要病机。黄芪始载于《神农本草经》，性温、味甘，具有补气固表、托毒排脓等功效。黄芪多糖(Astragalus polysaccharide，APS)为中药黄芪的主要有效成分，既往研究发现黄芪多糖能够通过提高免疫力改善宫颈癌和卵巢上皮性癌患者疗效[3-4]；能够通过调控信号传导和转录激活因子3(Signal transduction and activator of transcription factor 3，STAT3)、缺氧诱导因子1α(Hypoxia-inducible factor 1α，HIF-1α)、血管内皮生长因子(Vascular endothelial growth factor，VEGF)表达对口腔鳞癌、肝癌、胃癌均具有一定的抑制作用[5-7]。本研究旨在探讨黄芪多糖对小鼠食管癌前病变的影响及其机制，现报告如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物 清洁级健康雄性C57BL/6小鼠96只，5周龄、体重(20±2)g，购自河北医科大学生物医学工程中心[实验动物生产许可证号：SCXK(冀)2019-001]，饲养环境：室温(24±1)℃、相对湿度50%～70%，自由进食、饮水。本研究获得我院伦理委员会审核批准。

1.2 药物与试剂 注射用黄芪多糖(规格：100 mg/瓶)购自天津赛诺制药有限公司(批号：20200419)；全反式维甲酸、4-硝基喹啉-1-氧化物(4NQO)购自美国Sigma公司(批号：38H2079、SLBD6960)；CD3+、CD4+、CD8+T细胞和自然杀伤细胞(NK)细胞荧光素标记单克隆抗体购自北京博奥森生物技术有限公司(批号：BF0159、BF0174、BF0235、EC6872)；总RNA提取试剂盒、逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)试剂盒购自日本Takara公司(批号：20A0127C、AI61180A)；cDNA 逆转录试剂盒购自德国Thermo公司(批号：K1622)；二辛可宁酸(BCA)蛋白浓度检测试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司(批号：102517180413)；STAT3、HIF-1α、VEGF、β-actin抗体购自北京博奥森生物科技有限公司(批号：bs-55208R、bs-20399R、bs-1313R、bsm-33036M)；增强型化学发光(ECL)试剂盒购自美国Millipore公司(批号：WBKLS0500)。

1.3 主要仪器 RM2235型石蜡切片机(德国Leiea公司)；BX53型生物显微镜(日本Olympus公司)；FACS Cailobur型流式细胞仪(美国BD公司)；VELO18R型高速低温离心机(英国Dynamica公司)；EMUC7型超薄切片机(德国Leica公司)；H-7500型透射电子显微镜(日本Hitachi公司)；FSH-2型高速匀浆机(江苏金坛市佳美仪器有限公司)；DU640型蛋白核酸分析仪(美国Beckman公司)；ABI7500型RT-PCR仪(美国Thermo公司)；Power Pac型电泳仪(美国 Bio Rad公司)；VE-186型转膜仪(上海天能科技有限公司)。

1.4 实验方法

1.4.1 分组、造模：适应性饲养7 d后，按随机数字表法将144只实验用小鼠分为四组：正常组，模型组，黄芪多糖组和全反式维甲酸组，每组36只。除正常组外，其他组均参照纪晓花等[8]报道的方法，通过喂养4NQO溶液(100 μg/ml)15周诱导制备食管癌前病变小鼠模型。造模完成后，分别取正常组和模型组2只小鼠，颈椎脱臼处死后迅速剥取食管组织，行HE染色，通过光学显微镜观察发现，正常组小鼠食管上皮组织未见异常，模型组食管上皮组织呈现结构紊乱、细胞数量增多、出现异型细胞等病变，提示造模成功(图1)。

图1 正常组和模型组食管上皮组织病理学改变(HE染色，×400)

1.4.2 给药：造模完成后，黄芪多糖组50 mg/kg，1次/d，灌胃给药[相当于人临床剂量，换算公式：小鼠剂量(mg/kg)=12.27×人临床剂量(mg)/体重(kg)，人体重以60 kg计算]；全反式维甲酸组7.5 mg/kg，每2 d 1次，灌胃给药[8]；正常组和模型组灌胃给予0.9%氯化钠溶液，1次/d,共10周。

1.4.3 HE染色法观察食管上皮组织病理学改变：治疗完成后，每组随机取12只小鼠，颈椎脱臼处死后，立即剥取食管组织，用0.9%氯化钠溶液冲洗干净，去除筋膜，纵向切开、平铺、卷曲后置于4%多聚甲醛中固定72 h，经石蜡包埋、5 μm连续切片、展片处理后，行常规HE染色，封片后通过光学显微镜观察食管上皮组织病理学改变。参照胡艳华[9]报道的方法，由病理科医生对食管癌上皮组织病变进行判断。①正常：基底膜完整，上皮层薄厚均匀、细胞排列整齐；②单纯增生：基底膜完整，上皮层细胞排列整齐，但细胞数量增多、无异型细胞；③癌前病变：基底膜完整，上皮层组织结构紊乱，细胞数量增多、出现异型细胞；④癌变：基底膜完整，上皮层全部结构紊乱，细胞呈现多角形，胞核深染、位于细胞中央，可见病理性核分裂像。

1.4.4 透射电子显微镜观察食管上皮细胞超微结构改变：治疗完成后，每组随机取12只小鼠，颈椎脱臼处死后，立即剥取食管组织，修饰成1 mm×1 mm×1 mm小块后置于4%戊二醛溶液中固定2 h、四氧化锇固定1.5 h，梯度丙酮溶液脱水、环氧树脂包埋后行50 nm超薄切片，醋酸铀和柠檬酸铅依次染色30 min后，通过透射电子显微镜观察食管上皮细胞超微结构变化。

1.4.5 流氏细胞仪检测血液中CD3+、CD4+、CD8+T细胞和NK细胞比例：取各组剩余的12只小鼠，摘除眼球取血2 ml，4 ℃、3000 r/min离心10 min取沉淀，分别加入CD3+、CD4+、CD8+T细胞和NK细胞荧光素标记单克隆抗体，4 ℃孵育1 h，加入1 ml细胞洗液，4 ℃、300 g离心5 min取沉淀，加0.5 ml细胞洗液、将沉淀吹打均匀后，通过流式细胞仪测定血液中CD3+、CD4+、CD8+T细胞和NK细胞比例。

1.4.6 RT-PCR法检测食管上皮组织STAT3、HIF-1α、VEGF mRNA表达：颈椎脱臼处死后，立即剥取食管上皮组织，取100 mg食管上皮组织、提取并纯化总RNA，通过核酸分析仪检测RNA浓度后逆转录成cDNA，行RT-PCR扩增反应，反应条件为95 ℃ 30 s，95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，共进行40个循环，4 ℃ 5 min终止反应，然后通过凝胶分析仪成像。以β-actin为内参基因，采用2-△△Ct法计算mRNA相对表达量。STAT3、HIF-1α、VEGF、β-actin的RT-PCR引物序列见表1。

表1 RT-PCR引物序列

1.4.7 Western blot法检测食管上皮组织STAT3、HIF-1α、VEGF蛋白表达：取食管上皮组织100 mg，加入5倍量4 ℃裂解液研磨匀浆，4 ℃、12000 r/min离心30 min取上清液，通过BCA法测定蛋白浓度，十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白，转PDVF膜、5%牛血清白蛋白封闭2 h，STAT3(1∶500)、HIF-1α(1∶800)、VEGF(1∶500)、β-actin(1∶1000)抗体4 ℃孵育12 h，洗膜后IgG二抗(1∶2000)37 ℃孵育2 h，洗膜后ELC显色，以目标蛋白与内参(β-actin)条带灰度值的比值作为目标蛋白相对表达量。

1.5 统计学方法 运用SPSS 17.0统计学软件进行分析。本研究计量资料均符合正态分布，以均数±标准差表示，多组间比较采用单因素方差分析，方差齐的两两比较采用LSD-t检验，方差不齐的两两比较采用Dunnett T3法；计数资料比较以[例(%)]表示，采用χ2检验；P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组小鼠食管上皮组织病理学改变比较 正常组小鼠食管上皮组织基底膜完整，上皮层薄厚均匀、细胞排列整齐；模型组小鼠食管上皮组织呈现黏膜充血、色泽灰暗，上皮层组织结构紊乱，细胞数量增多、出现异型细胞，可见点状或条状白色斑块不典型增生灶、原位癌病灶等病理学改变；与模型组比较，黄芪多糖组和全反式维甲酸组食管上皮组织病理学改变明显改善，其中黄芪多糖组病变未超过上皮层下1/3处、未见原位癌病灶，效果优于全反式维甲酸组。正常组小鼠食管上皮组织未见癌前病变或癌变；模型组食管上皮组织癌变率66.67%；与模型组比较，黄芪多糖组和全反式维甲酸组癌变率显著降低(P<0.05)；与全反式维甲酸组比较，黄芪多糖组癌变率显著降低(P<0.05)。见表2(图2)。

图2 各组小鼠食管上皮组织病理学改变(HE染色，×400)

表2 各组小鼠食管上皮组织病理学改变比较[例(%)]

2.2 各组小鼠食管上皮组织细胞超微结构改变比较 正常组小鼠食管上皮组织细胞排列整齐，胞核居中，核膜核仁清晰；模型组小鼠食管上皮组织基底细胞增生多层，细胞数量增多、排列紊乱、胞核大小不等、核分裂相增多等超微结构改变；与模型组比较，黄芪多糖组和全反式维甲酸组食管上皮组织细胞超微结构改变明显改善，其中黄芪多糖组效果优于全反式维甲酸组(图3)。

图3 各组小鼠食管上皮组织细胞透射电子显微镜下超微结构改变(×10000)

2.3 各组小鼠血液中CD3+、CD4+、CD8+T细胞和NK细胞比例比较 与正常组比较，模型组小鼠血液中CD3+、CD4+T细胞和NK细胞比例均降低，CD4+/CD8+比值降低，CD8+T细胞比例均升高(P<0.05)；与模型组比较，黄芪多糖组和全反式维甲酸组CD3+、CD4+T细胞和NK细胞比例均升高，CD4+/CD8+比值升高，CD8+T细胞比例降低(P<0.05)；与全反式维甲酸组比较，黄芪多糖组CD3+、CD4+T细胞和NK细胞比例均升高，CD4+/CD8+比值升高，CD8+T细胞比例降低，两组比较差异具有统计学意义(P<0.05)。见表3。

表3 各组小鼠血液中CD3+、CD4+、CD8+ T细胞和NK细胞比例比较

2.4 各组小鼠食管上皮组织STAT3、HIF-1α、VEGF mRNA表达比较 见表4。与正常组比较，模型组小鼠食管上皮组织STAT3、HIF-1α、VEGF mRNA表达量均显著升高(P<0.05)；与模型组比较，黄芪多糖组和全反式维甲酸组STAT3、HIF-1α、VEGF mRNA表达量均显著降低(P<0.05)；与全反式维甲酸组比较，黄芪多糖组STAT3、HIF-1α、VEGF mRNA表达量均显著降低(P<0.05)。

表4 各组小鼠食管上皮组织STAT3、HIF-1α、VEGF mRNA表达比较

2.5 各组小鼠食管上皮组织STAT3、HIF-1α、VEGF蛋白表达比较 与正常组比较，模型组小鼠食管上皮组织STAT3、HIF-1α、VEGF蛋白表达量均显著升高(P<0.05)；与模型组比较，黄芪多糖组和全反式维甲酸组STAT3、HIF-1α、VEGF蛋白表达量均显著降低(P<0.05)；与全反式维甲酸组比较，黄芪多糖组STAT3、HIF-1α、VEGF 蛋白表达量均显著降低(P<0.05)。见表5(图4)。

表5 各组小鼠食管上皮组织STAT3、HIF-1α、VEGF蛋白表达比较

图4 各组小鼠食管上皮组织STAT3、HIF-1α、VEGF蛋白表达

3 讨 论

食管癌是我国最常见的上消化道恶性肿瘤，其中超过90%的患者病理分型属于鳞状细胞癌。食管癌鳞状细胞癌的发生及进展是一个多阶段的渐进过程，主要经历单纯增生、癌前病变、癌变等阶段，其中癌前病变以异型细胞层不超过食管上皮层下1/3处、上皮层下1/3至2/3处、超过上皮层下2/3处分为轻、中、重度，癌变过程分为原位癌、浸润性鳞状细胞癌两个阶段。流行病学调查研究发现，从食管轻度癌前病变发展为原位癌，需要约5～10年时间[10]。范焕芳等[11]研究发现在癌前病变阶段给予适当药物干预，能够诱导食管上皮细胞向正常细胞分化，降低癌变率。

中药黄芪具有补气固表、托毒排脓、托疮生肌等功效，常用于气虚乏力、久泻脱肛、子宫脱垂等症的治疗。黄芪多糖为黄芪的主要活性成分，对食管癌细胞生长具有抑制作用[12]、对食管癌细胞化疗敏感性具有改善作用[13]，但黄芪多糖是否对食管癌前病变具有抑制作用尚未见文献报道。4NQO是一种水溶性喹啉衍生物致癌剂，其代谢产物4-羟氨基喹啉-1-氧化物与DNA形成加合物，使第7号染色体第12位密码子发生嘌呤-腺苷转换，导致DNA突变而致癌[14]。4NQO饮水法诱导制备的食管癌小鼠模型为鳞状细胞癌，较符合人类食管癌90%以上为鳞状细胞癌的病理特点，并且该方法成模自然、操作简单，是国内外普遍认可的食管癌动物模型制备方法[15]。全反式维甲酸是一种肿瘤细胞分化逆转剂，具有抑制肿瘤细胞增殖并诱导细胞向正常细胞分化的作用[16]。本研究发现，食管癌前病变模型小鼠食管上皮组织呈现结构紊乱，出现异型细胞、不典型增生灶、原位癌病灶等病理学改变；食管上皮细胞可见胞核大小不等、核分裂相增多等超微结构改变，与纪晓花等[8]报道一致。经黄芪多糖治疗能够明显改善食管癌前病变小鼠食管上皮组织病理学改变和上皮细胞超微结构病变，癌变率显著降低，黄芪多糖组效果优于全反式维甲酸组，提示黄芪多糖对小鼠食管癌前病变进展具有抑制作用。

免疫功能下降是食管癌发生发展的重要因素，因此提高食管癌患者机体免疫功能是改善其预后的有效途径[17]。Chraa等[18]研究发现T细胞亚群和NK细胞在机体抗肿瘤免疫反应过程中挥着重要的调节作用。CD3+是T细胞成熟的标志，能够反映T细胞总量；CD4+T细胞能够辅助B淋巴细胞产生抗体而杀伤肿瘤细胞；CD8+T细胞对细胞免疫具有负调控作用，表现为抑制免疫作用；CD4+/CD8+比值能够反映机体免疫功能状态[19]。本研究发现，经黄芪多糖治疗能够明显提高食管癌前病变小鼠血液中CD3+T细胞、CD4+T细胞、NK细胞比例并降低CD8+T细胞比例，提高CD4+/CD8+比值，并且黄芪多糖组对各指标的调控作用优于全反式维甲酸组，提示黄芪多糖对食管癌小鼠细胞免疫功能具有改善作用。

血管新生是食管癌发生发展的重要因素，为肿瘤组织生长供给养分、为癌细胞转移提供通道。研究表明，若没有新生血管，实体瘤体积不会超过2 mm[20]。STAT3是哺乳动物细胞中普遍存在的一种核转录因子，对细胞增殖、分化、凋亡等具有重要的调控作用[21]。VEGF具有促进内皮细胞增殖、分裂等生物学活性，是促进肿瘤组织血管生成最直接、最重要的细胞因子。STAT3能够与VEGF启动子特异位点结合而诱导VEGF转录表达。肿瘤细胞快速增殖导致局部乏氧、诱发HIF-1α表达，HIF-1α能够诱导VEGF表达而增加肿瘤组织微血管密度；HIF-1α为STAT3的下游靶基因，因此，STAT3也能够通过诱导HIF-1α表达而间接诱导VEGF转录表达[22]。研究发现，经黄芪多糖治疗能够明显降低食管癌前病变小鼠食管上皮组织STAT3、HIF-1α、VEGF mRNA和蛋白表达，黄芪多糖组效果优于全反式维甲酸组，这可能是黄芪多糖抑制小鼠食管癌前病变进展的重要机制。

综上所述，黄芪多糖对小鼠食管癌前病变进展具有抑制作用，其机制可能与提高细胞免疫功能及抑制STAT3、HIF-1α、VEGF转录表达有关。本研究为黄芪多糖用于食管癌前病变的治疗提供了理论依据。