补肾活血方联合补佳乐对宫腔粘连大鼠YAP1/TGF-β1信号通路的影响

闫晓彤，朱 婷，章晓乐，齐 聪，蒋国静，胡攀伟

(上海中医药大学附属曙光医院妇科，上海 201203)

宫腔粘连(Intrauterine adhesions，IUA)是在感染、流产手术、宫腔操作等因素所致的子宫内膜基底层损伤后，引发的宫腔或宫颈管内膜破坏、局面创面粘连，临床上主要表现为月经过少、闭经、复发性流产、不孕等[1-2]。近些年来，由于性生活的年轻化，人工流产宫腔操作频率的增加，IUA日益成为威胁女性生殖健康的重要杀手[3-4]。目前IUA主要采用宫腔镜下粘连松解术，辅以术后雌孕激素治疗，但是这种疗法仅对轻、中度IUA有一定疗效，同时术后常出现薄型子宫内膜、粘连复发等并发症[5-6]。补肾活血方前期研究表明补肾活血方可以有效增加IUA患者术后子宫内膜厚度，改善子宫内膜供血，预防宫腔再次粘连[7]。Hippo通路是一条由多种蛋白激酶和转录因子共同构成的激酶通路，通过多途径与TGF-β 信号发生交汇，参与子宫内膜纤维化调控进程[8-9]。YAP/TGF-β 信号通路能够调节成纤维细胞分化为肌成纤维细胞，介导纤维化进程[10-12]。本研究通过双重损伤建立宫腔粘连模型，运用组织学染色观察大鼠子宫内膜病理，免疫组化检测YAP1/TGF-β1蛋白表达，统计孕囊数目进行生育力评估，系统性评价益气活血方的临床应用价值，探讨其内在的调控机制。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物：清洁级雌性SD大鼠40只(斯莱克实验动物有限公司)，体重约为(200±20)g，饲养于上海中医药大学动物房中，自由摄食饮水，人工光照明暗交替12 h，饲养室温度为(25±2)℃，相对湿度30%～70%。本研究经过上海中医药大学实验动物福利与伦理委员会批准同意。实验动物许可证号SCXK(沪)20020-00058。

1.1.2 实验试剂与仪器：YAP1抗体(批号ab76252)，TGF-β1抗体(批号ab31013)，二甲苯(国药集团有限公司)，苏木素伊红染色(索莱宝)，Masson三色试剂盒(珠海贝索有限公司)，中性福尔马林固定液(索莱宝试剂有限公司)，中性树胶(国药集团有限公司)，补佳乐(批号20171038，拜耳有限公司)，超低温冰箱(三洋公司)，显微镜(奥林巴斯公司)，石蜡切片机(徕卡公司)。

1.2 实验方法

1.2.1 实验药物：补肾活血方由黄芪30 g，巴戟天、当归、水蛭各15 g，牛膝18 g，熟地黄12 g，鹿角片、川芎各9 g，炙甘草6 g组成。中药购自上海万仕诚药业，由上海中医药大学附属曙光医院制剂室煎煮而成，参照人与大鼠体表面积换算系数0.018[13]，将中药制备成每1 ml 含1.16 g原药材的汤剂，留存于4 ℃ 冰箱。补佳乐用量参照课题组前期研究[14]，将补佳乐碾成粉末，取0.18 g溶于10 ml 0.9%氯化钠溶液，留存于4 ℃冰箱。补肾活血方与补佳乐混悬液即在前期中药制备基础上直接加入补佳乐粉末，充分摇匀，留存于4 ℃冰箱。

1.2.2 动物分组、建模与给药：大鼠适应性喂养3 d后，以阴道脱落细胞法选择处于动情周期的大鼠进行造模手术。将40只雌性大鼠按照随机数字表分为假手术组、模型组、中药组、西药组、中药+西药组，每组8只。假手术组仅切开皮肤然后缝合处理，其余各组通过手术建立IUA模型，参照前期课题组方法[14]制备IUA模型。首先将医用无菌术线浸泡于脂多糖溶液过夜，待大鼠完全麻醉后切开下腹部轻轻分离出子宫，在子宫颈上方约5 mm处作纵行切口，利用刮勺经切口进入行刮宫术，当宫腔四壁出现粗糙感时停止刮宫，随后将脂多糖棉线置入宫腔加重感染，并在腹壁留一尾丝以便后续取出，最后运用0.9%氯化钠溶液冲洗腹腔，缝合腹壁，待24 h后取出棉线，9 d后即可形成大鼠IUA模型。当造模成功后开始灌胃给药，1次/d，每次2 ml，假手术组与模型组予0.9%氯化钠溶液，中药组予补肾活血方11.61 g/kg，西药组予补佳乐0.18 mg/kg，中药+西药组予补肾活血方与补佳乐混悬液，各组连续灌胃28 d，末次给药24 h后选取4只大鼠处死，进行双侧子宫取材和重量称量，剩余4只大鼠与雄鼠进行合笼。

1.2.3 HE染色检测子宫内膜组织病理变化：采用中性福尔马林固定固定标本后，经过梯度乙醇脱水、二甲苯透明、石蜡包埋后切片，脱蜡至水，按照试剂盒说明书依次进行HE染色，中性树胶封片。待过夜晾干后，在高倍镜下(100倍)随机选择5个视野，记录子宫内膜腺体数及内膜厚度，计算其平均值。

1.2.4 Masson染色检测子宫内膜纤维化程度：每组剩余的石蜡切片经过脱蜡至水、苏木精液染核、丽春红酸性复红液染色、冰醋酸水溶液浸洗、磷钼酸水溶液分化、苯胺蓝染色、二甲苯透明等操作后，以中性树胶封片。待过夜晾干后，在高倍镜下(100倍)随机选取5个视野，用Image J软件计算得到子宫内膜间质纤维化百分比，记录其平均值。

1.2.5 免疫组化检测子宫内膜YAP1与TGF-β1蛋白：对每组剩余石蜡标本进行二甲苯脱蜡、乙醇水化、内源性过氧化氢酶去除、抗原修复等操作，随后滴加5% 的牛血清蛋白封闭1 h，再分别孵育一抗(YAP1 1∶200；TGF-β11∶200)与对应的荧光二抗(1∶1000)，接着给予DAPI(1∶1000)避光染核2 min，最后滴加防淬灭封片剂封片。待玻片晾干后置于荧光显微镜下观察记录，用Image J软件计算免疫组化中的阳性细胞百分比。

1.2.6 生育力测定：每组选取剩余4只大鼠，与雄鼠以2∶1比例进行合笼交配，7 d后处死大鼠，记录大鼠双侧子宫胚胎植入数目。

1.3 统计学方法 采用SPSS 22.0统计学软件进行分析。计量资料以均数±标准差表示，对于多样本均数间的比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用Dunnett’s法；P<0.05表示差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组大鼠子宫内膜组织形态学比较 见图1(表1)。给药结束后，剖视见假手术组子宫外观形态正常，质软，色粉红，造模组大鼠子宫与周围组织偶见疏松粘连，子宫质略硬，外观形态略有粗细不均，表面见瘀血状红点。通过HE切片染色，发现假手术组子宫内膜腔表面有丰富完整的子宫内膜腺体和多个腺体围绕的腺体腔，模型组大鼠子宫腔腺体紊乱破碎，腔壁呈现较多炎性细胞，出现粘连甚至闭锁现象。与假手术组相比，各组子宫内膜厚度变薄(P<0.05)；与模型组相比，中药+西药组大鼠子宫内膜明显增厚(P<0.05)，单用中药与西药虽内膜厚度有所增加，但经比较差异无统计学意义(P>0.05)。在内膜腺体数量上，与假手术相比，模型组腺体明显减少(P<0.05)，中药+西药组也有所减少，组间比较差异无统计学意义(P>0.05)；与模型组比较，中药+西药组的腺体明显增多(P<0.05)，中药组与西药组虽有增加，但差异无统计学意义(P>0.05)。经过药物灌胃后中药、西药、中药+西药组均有一定的改善，但中药+西药组宫腔改善较为明显，子宫腔的腺体数量更多，子宫内膜厚度增加，炎症细胞浸润明显减少。

图1 各组大鼠子宫内膜组织病理变化(HE染色，×100)

表1 各组大鼠子宫内膜厚度与腺体数量比较

2.2 各组大鼠子宫内膜纤维化程度比较 见图2(表2)。通过内膜组织Masson染色，发现与假手术组比较，模型组蓝色胶原纤维分布不规则，可见沉积现象，蓝染纤维化面积明显升高，差异有统计学意义(P<0.05)；与模型组比较，中药组、西药组、中药+西药组治疗后胶原纤维的染色现象均无模型组明显，纤维化程度明显减轻(P<0.05)；与中药+西药组比较，单用中药与西药的纤维化程度更高(P<0.05)，提示中药+西药组能够发挥抑制IUA纤维化的最大效应。

表2 各组大鼠子宫内膜纤维化程度比较(%)

图2 各组大鼠子宫内膜纤维化程度(Masson染色，×100)

2.3 各组大鼠子宫内膜YAP1与TGF-β1蛋白比较 见图3、4(表3)。与假手术组比较，模型组YAP1蛋白显著增高(P<0.05)；与模型组比较，中药组、中药+西药组三组子宫内膜YAP1蛋白表达明显下降(P<0.05)，而西药组YAP1蛋白表达差异无统计学意义(P>0.05)；与中药+西药组比较，单用中药与西药的YAP1蛋白表达更多(P<0.05)。与假手术组比较，模型组子宫内膜TGF-β1蛋白显著增高(P<0.05)；与模型组比较，中药+西药组TGF-β1蛋白表达明显下降(P<0.05)，中药组与西药组的TGF-β1蛋白表达量也呈现下降趋势，但差异无统计学意义(P>0.05)；与中药+西药组比较，西药组TGF-β1蛋白表达明显增加，差异具有统计学意义(P<0.05)，而中药组差异无统计学意义(P>0.05)。

表3 各组大鼠子宫内膜YAP1和TGF-β1蛋白阳性率比较(%)

图3 各组大鼠子宫内膜YAP1蛋白比较(免疫组化染色，×100)

2.4 各组大鼠妊娠结局比较 见表4。通过计算大鼠孕囊数目后发现，假手术组胚胎孕囊成串珠状排列于子宫，单侧孕囊7～9个不等。与假手术组比较，仅中药+西药组大鼠见2枚妊娠孕囊，差异具有统计学意义(P<0.05)，其余各组大鼠均未发现孕囊；与模型组比较，中药+西药组孕囊数目差异有统计学意义(P<0.05)。

图4 各组大鼠子宫内膜TGF-β1蛋白比较(免疫组化染色，×100)

表4 各组大鼠妊娠结局比较(个)

3 讨 论

目前宫腔镜下粘连分解术是宫腔粘连最常见的治疗手段，但是术后复发率高达30%～62.5%，常需要配合雌激素辅助促进子宫内膜生长、修复手术创面，在宫腔粘连的治疗上仍有必要研究新的治疗策略，解决宫腔粘连复发和妊娠率低下的难题[15]。本研究采用机械和感染双重因素建立IUA模型，通过形态学染色发现中药组+西药组能够有效改善宫腔粘连，抑制内膜纤维化，相比于中药或者西药单独应用，中药与西药的联合应用疗效更明显。通过免疫组化蛋白检测发现中药+西药组能够有效抑制YAP1/TGF-β1蛋白表达，其抑制作用优于单用中药或西药。观察妊娠结局，发现中药+西药联合应用能够促进孕囊个数，而单用中药或西药时，宫腔粘连大鼠的妊娠结局未能得到改善。

在IUA的发病机制上，目前主要认为是由于子宫内膜基底层损伤造成上皮细胞和间质细胞再生增多，新生血管形成受阻，伴有成纤维细胞裂解酶活性降低、成纤维细胞大量增殖，最终形成宫腔粘连纤维样和瘢痕内膜[16]。IUA的特征性病理变化是组织纤维化，这种纤维化是由包括TGF-β 在内诸多生长因子调节。TGF-β1作为一种条件细胞生长、侵袭、黏附、迁移的多功能细胞因子，参与Smad信号通路调控胶原纤维产生和纤维化进程，下调TGF-β 信号能够减少细胞外基质产生和沉积，抑制宫腔粘连进展[17]。Hippo通路是一条进化高度保守的信号转导通路，通常情况下以核心激酶MST1/2～LATS1/2磷酸化依赖的方式负向调控下游关键效应蛋白YAP/TAZ。当Hippo通路被激活时，YAP/TAZ被磷酸化滞留于细胞质，而当Hippo通路被抑制时，YAP/TZA未被磷酸化，得以易位入核，刺激基因表达[18]。研究表明Hippo通路能够调控TGF-β 通路，敲除Hippo通路上游LATS激酶，能够恢复YAP/TAZ核定位和TGF-β 转录，促进纤维化进程[7]。

中医认为肾虚精血不足，血瘀气滞是宫腔粘连的基本病机，治疗关键在于补肾填精，补血活血[19-20]。补肾活血方是上海市名中医齐聪教授治疗宫腔粘连的临床经典用方，以血肉有情之品鹿角为君药，菟丝子、巴戟天、熟地为臣，填精补肾，黄芪补气，气为血之帅，气行则血行，更用虫类药水蛭，引药入胞宫，联用当归、牛膝、川芎，补血活血，再予炙甘草调和诸药，全方补而不滞，滋而不腻，共奏补肾活血之功。本研究模拟临床实际治疗方案，探究了中药组、西药组、中药+西药组对宫腔粘连的治疗作用，发现补肾活血方与补佳乐联用能够有效抑制宫腔纤维化，改善子宫内膜厚度和腺体数，恢复宫腔功能，这可能与其能激活Hippo通路，抑制YAP/TGF-β 信号转录作用相关。通过观察妊娠结局，发现补肾活血方联合补佳乐可能通过改变宫腔粘连提升大鼠子宫内膜容受性，改变妊娠结局。本研究论证了补肾活血方联合补佳乐对宫腔粘连大鼠的治疗作用以及其对YAP1/TGF-β1通路的干预调控，但对于其中的上下游分子机制仍不明确，还需设计进一步的相关实验验证其内在的分子机制，为补肾活血方联合补佳乐治疗宫腔粘连的临床应用提供理论依据。

综上所述，补肾活血方联合补佳乐治疗可通过抑制YAP1/TGF-β1信号通路降低纤维化，恢复宫腔粘连大鼠子宫内膜容受性，从而有效治疗宫腔粘连，改善妊娠结局。