星点设计-效应面法优化胰蛋白酶提取鱼腥草多糖的工艺研究

杜晶，游国叶，樊轻亚

（信阳职业技术学院，河南 信阳 464000）

鲜鱼腥草为三白草科植物蕺菜属蕺菜的新鲜全草或干枯的地上部分[1]，具有清热解毒、消肿排脓、利尿通淋的功效，可治疗肺痈吐脓、痰热喘咳、热淋、热痢、痈肿疮毒等症[2]。现代药理研究表明鱼腥草具有抗肿瘤、抗病毒和抗炎等作用[3]。其水溶性多糖具有抗菌、抗病毒、提高机体免疫力和利尿等作用[4]。

目前鱼腥草多糖未见CCD优化胰蛋白酶提取鱼腥草多糖的方法，本课题组以鱼腥草为研究对象，采用星点-效应面优化胰蛋白酶多糖提取工艺，旨在为鱼腥草多糖相关产品的研究开发提供一定的依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器

UV2000紫外-可见分光光度计，北京普析通用仪器有限责任公司；电热恒温水浴锅，江苏金坛市宏华仪器厂；天平，JYT-10型，上海医用激光仪器厂；循环水真空泵，SHB3，上海申生科技有限公司；数显鼓风干燥箱，GZX-9240MBE，上海博迅实业有限公司医疗设备厂；电子天平，AY120，日本岛津株式会社。

1.2 试剂与药品

葡萄糖标准品，批号080621，Sigma公司；胰蛋白酶，批号081105，广州市齐云生物生产；苯酚、浓硫酸、氨水、95%乙醇，均为分析纯，苯酚试液参考文献[5-7]配制。鱼腥草全草购于河南药材公司。

2 方法与结果

2.1 鱼腥草多糖提取方法的建立

精密称取105 ℃干燥至恒重的葡萄糖0.099 g，加水溶解并定容至 100 mL，配制得质量浓度为0.99 mg·mL-1的葡萄糖对照品贮备液。分别精密称定葡萄糖标准液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mL，置10 mL容量瓶中加水至刻度线，摇匀，再分别取1 mL，加1 mL 5%苯酚溶液、5 mL浓硫酸显色40 min以上。另取1 mL蒸馏水，加同量苯酚和浓硫酸，同法操作，作为空白对照。置UV2000型分光光度计中，于490 nm测定吸收度，以吸收度（Y）对葡萄糖质量浓度（X）进行回归，得标准曲线方程:Y=8.428 6X-0.025 8，相关系数为0.995 9。结果表明葡萄糖在0.019 7～0.058 9 mg·mL-1范围内呈良好的线性关系。

分别称取鱼腥草药材5.0 g，按照星点设计表进行提取粗多糖，精密称取于50 ℃烘干至衡重的粗多糖0.100 0 g，加水溶解并定容至50 mL，摇匀，再取1 mL定容至10 mL容量瓶中，得供试品，分别取供试品1 mL，置于试管中，加1 mL苯酚、5 mL浓硫酸，振摇均匀，显色40 min以上。另取1 mL 蒸馏水，加同量苯酚和浓硫酸，同法操作吗，作为空白对照。置UV2000型分光光度计中，于490 nm测定吸收度，求得多糖含量。

2.2 方法学考察

2.2.1 稳定性试验

取葡萄糖标准液0.8 mL，定容到10 mL容量瓶中，再取1 mL，苯酚-硫酸法显色，每隔20 min测定一次吸收度，连续2 h考察其稳定性，结果见表1。结果表明供试液在2 h显色稳定，RSD=0.30%

表1 稳定性试验

2.2.2 精密度试验

取葡萄糖标准液0.5 mL，定容至10 mL容量瓶中，再取1 mL，苯酚-硫酸法显色，连续测定5次，测定结果见表2，RSD=1.4%，表明精密度良好。

表2 精密度试验

2.2.3 重复性试验

精密称取50 ℃干燥至恒重的鱼腥草粗多糖6份，分别置于100 mL的容量瓶中复溶，再取2 mL定容至10 mL，按标准曲线项下的方法操作，测定吸光度，结果见表3。

表3 重现性实验结果（n＝6）

从表3结果可以看出，用苯酚-硫酸法进行鱼腥草多糖的分析，重现性好，实验结果可靠。

2.2.4 加样回收率测定

精密称取样品5 g，加入精制多糖600 mg，精密称定，按样品制备方法操作，精密量取1.0 mL，苯酚-硫酸法显色，于490 nm波长处用可见紫外分光光度计测定，结果见表4。

表4 加样回收率测定

2.3 胰蛋白酶提取鱼腥草多糖最佳条件的优选

根据文献报道[8-10]并结合实际，确定影响酶法提取多糖的因素主要有酶添加量、pH值、温度、时间等，在单因素实验的基础上以pH＝7和40倍鱼腥草药材体积水提取多糖，根据笔者单因素考察实验结果发现，胰蛋白酶的量、酶解温度、酶解时间对鱼腥草多糖的得率有显著影响，故采取星点-效应面法[11-12]对其提取工艺进行优化，根据星点设计原理对各因素进行了5水平设计，开展实验，各因素水平分布见表5。

表5 星点设计因素水平表

使用Design Expert8.0.6版软件对数据进行回归分析，得多元线性回归拟合方程Y=21.48+0.66A-0.055B+2.71C，P=0.085 9，r=0.574 5。二项式拟合方程Y=21.48+0.66A-0.055B+2.71C-0.25AB+0.27AC+0.87BC-2.59A2-1.61B2-2.40C2，P=0.000 2，r=0.9612。二项式拟合方程的相关系数较高，表明该模型的拟合程度高，预测性好，因此选用二项式拟合模型来优化实验方案，进行方差分析，数据见表6。

表6 效应面二次模型的方差分析结果

方差分析结果显示，该二项式拟合模型F=13.50，P＜0.01，表明该模型具有显著性，=0.855 5，说明因变量和自变量之间有显著的线性关系，由R2=0.923 9可知预测值和真实值之间有较高的相关性，综上所述，该模型与实际情况的拟合程度较好，可用于评价鱼腥草多糖的提取量的实际情况。

根据所拟合的二项式，应用CCD绘制各因素对多糖含量影响的三维效应面图，见图1。在酶添加量和酶解温度交互三维图中，当温度一定，鱼腥草多糖提取量随着酶量的增加先增加后下降，当酶量不变时，随着温度的提升，多糖的提取量也是先升高再降低，多糖提取量比较高的范围为，酶添加量（2.0，2.3），酶解温度（43，45）；由酶加量和酶解时间交互图可知，酶添加量（1.5，2.5）、酶解时间（144,180）的时候，鱼腥草多糖的提取量高；由酶解温度和酶解时间的交互图可知，酶解温度（42，48）、酶解时间（144，188）。再结合二次多项式拟合方程求偏导得到最佳提取条件为酶添加量为2%，酶解温度为45 ℃，酶解时间为150 min，多糖的理论提取量为25.99，与实测值25.93基本相符，因此采用星点-效应面法得到的胰蛋白酶提取鱼腥草多糖的提取工艺具有实际应用价值。

图1 酶添加量、酶解时间、酶解温度对胰蛋白酶提取多糖含量的影响

3 结 论

将星点-效应面法应用于胰蛋白酶提取鱼腥草多糖提取工艺的优化，结合单因素试验，确定酶添加量、酶解时间、酶解温度3个影响因素，然后采用星点-效应面对提取条件进行优化，运用Design-expert 8.0.6软件安排试验并进行数据处理，所得提取条件（酶添加量为2%、酶解时间为150 min、酶解温度为45 ℃）稳定可控，工艺简便，便于工业化操作，可谓鱼腥草多糖的进一步研究提供科学依据。