反硝化聚磷菌NG4干粉菌剂制备条件优化

李 微，刘 宁，朱心雨，孙慧智

(1.沈阳建筑大学市政与环境工程学院，辽宁 沈阳 110168；2.中国市政工程东北设计研究总院有限公司，吉林 长春 130021)

氮和磷的超标排放是造成水体污染和富营养化的主要原因之一[1]。因此，对水体富营养化进行控制，探求高效率低能耗的生物脱氮除磷技术已然是我国处理水环境问题的重中之重[2]。反硝化聚磷菌(Denitrifying Poly-phosphorus Accumulating Organism，DPAO)在厌氧条件下利用聚磷菌分解体内的多聚磷酸盐(poly-P)产生能量，吸收可挥发性脂肪酸(VFA)并合成PHB贮存于体内;在缺氧条件下可以同时完成过量摄入磷及反硝化反应过程，从而实现同步脱氮除磷[3-6]。反硝化脱氮除磷工艺具有运行周期短、吸磷速率快的优势，与传统的除磷脱氮技术相较，耗氧量更少，能量消耗更低，缩短了反应时间[7-8]，并解决了聚磷菌和反硝化菌碳源竞争的矛盾以及聚磷菌和硝化菌泥龄差异的矛盾，实现了“一碳两用”。郑喜春[9]采用自制水族箱的方式确定了菌株TGR30、LG1-6、YB1按1∶1∶1比例混合制备的菌剂其脱氮除磷率最佳，总接菌量为1%时总氮去除率达到95%，磷去除率为17.70%。张文艺等[10]得出反硝化聚磷菌菌剂种子液适宜的培养条件为：温度30～32 ℃，溶解氧相当于70%～88%饱和溶解氧，培养时间15～20 h。吴晓娜等[1]通过研究不同接种比对反硝化聚磷菌菌剂脱氮除磷效应的影响，确定菌种初始接种比为2%体系的脱氮除磷效果最好。目前有关反硝化聚磷菌菌剂的研究还停留在实验室研究阶段[11],大部分局限于液态菌剂,且液态菌剂存在不便于运输、保质期短和施用工艺复杂、人工成本较高等不足，同时考虑其稳定性及贮藏时间的研究较少，鉴于此,笔者以高效反硝化聚磷菌NG4为研究对象，优化干粉菌剂制备条件，同时对其稳定性进行研究，旨在为反硝化聚磷菌在废水生物处理实际工程实践中的应用提供理论依据和技术支持。

1 试 验

1.1 菌种来源

分离用泥采用稳定运行的SBR反应器[12-13]中某缺氧段的活性污泥混合液。采用稀释涂布法和平板划线分离法进行分离纯化，并辅以生理生化及染色试验，最终筛选出具有同步脱氮除磷作用的反硝化聚磷菌6株，选择其中一株N4进行紫外诱变得8株纯菌株，经吸磷释磷试验发现NG4反硝化除磷效率最高，16S rDNA测定其为戈登氏菌属。试验以NG4作为研究对象，优化反硝化聚磷菌菌剂的制备条件。

1.2 培养基

反硝化培养基：琼脂为15 g/L，KNO3为1 g/L，KH2PO4为1 g/L，柠檬酸钠为5 g/L，K2HPO41 g/L，MgSO4·7H2O为0.2 g/L，pH值为7.2～7.4。

PAM培养液：酸氢磷二钠为3.06 g/L，硫酸铵为2.75 g/L，磷酸二氢钾为3 g/L，氯化钙为0.25 g/L,柠檬酸钠为4.0 g/L，七水硫酸镁为0.20 g/L，氯化钠为2.5 g/L，蔗糖为0.01 g/L[14]。

牛肉膏蛋白胨培养基：蛋白胨为10 g/L，牛肉膏为3 g/L，氯化钠为5 g/L，pH值为7.2～7.4[15]。

酵母浸出汁：酵母膏为5 g/L。

灭菌条件：压强为1.03×105Pa，温度为121 ℃，时间为20 min。

1.3 试验用水水质

以人工合成的生活污水作为试验用水，以NH4Cl作为氮源，KH2PO4为磷源，无水乙酸钠作为外加碳源，并添加无水氯化钙，MgSO4·7H2O及微量元素。水温调节为25 ℃，并通过NaHCO3调节进水的pH值为7.5～7.8。试验配水水质如表1所示。每次试验前配置人工模拟废水，并对其进行高压湿热灭菌，冷却后备用。

表1 试验配水水质Table 1Quality of experimental water mg/L

1.4 NG4干粉菌剂制备方法

以种子液为对象制备干粉菌剂。在转速为120 r/min、温度为30 ℃、初始pH为6.5的条件下培养20 h得到Poly-P颗粒的NG4种子液，取适量种子液在4 000 r/min的低速离心机中离心10 min，去除上清液用无菌水重悬，洗涂离心，反复冲洗2～3次。加入PAM培养液和相应体积的牛肉膏蛋白胨培养液，使菌体重悬;并将其倒入进行灭菌处理、过筛后的载体中，在温度为35 ℃、转速为120 r/min 条件下发酵8 h。将其放置于培养皿内，在温度为30 ℃的条件下进行干燥制成菌剂成品。

1.5 制备菌剂条件优化

1.5.1 载体配比

制备NG4种子液且离心获得菌种,灭菌后麦麸与玉米粉的质量比分别为75∶25、80∶20、85∶15、90∶10、95∶5、100∶0,投菌量为20 mL,加入2 mL PAM培养液,20 mL牛肉膏蛋白胨培养液，调节pH为6.5,并按制备方法制成菌剂成品。

1.5.2 投菌量

制备NG4种子液且离心获得菌种,试验设置0、10、20、30、40、50 mL共6种不同梯度的投菌量,加2 mL的PAM培养液,20 mL牛肉膏蛋白胨培养液，灭菌后的载体配比m(麦麸)∶m(玉米粉)=85∶15,调节pH为6.5,并按制备方法制成菌剂成品。

1.5.3 发酵液用量

制备NG4种子液且离心获得菌种,发酵液用量分别为5、10、15、20、25、30 mL,投菌量为20 mL,PAM培养液为2 mL,灭菌后的载体配比m(麦麸)∶m(玉米粉)=85∶15,调节pH为6.5,按制备方法制成菌剂成品。

1.5.4 发酵液pH值

制备NG4种子液且离心获得菌种,投菌量为20 mL,PAM培养液为2 mL,发酵液用量为20 mL，灭菌后的载体配比m(麦麸)∶m(玉米粉)=85∶15,调节培养基的pH分别为5.5、6.5、7.0、7.5、8.0，按制备方法制成菌剂成品。

1.6 分析测定方法

2 结果与分析

2.1 NG4干粉菌剂制备条件及优化效果

2.1.1 载体质量比对菌剂脱氮除磷效率的影响

图1 载体质量比对菌剂脱氮除磷效率的影响Fig.1Effects of carrier mass ratio on nitrogen and phosphorus removal efficiency

2.1.2 投菌量对菌剂脱氮除磷效率的影响

图2 投菌量对菌剂脱氮除磷效率的影响Fig.2Effects of bacterial dosage on nitrogen and phosphorus removal efficiency

2.1.3 发酵液用量对菌剂脱氮除磷效率的影响

图3 发酵液用量对菌剂脱氮除磷率的影响Fig.3Effects of fermentation broth dosage on nitrogen and phosphorus removal rate

2.1.4 发酵液pH值对菌剂脱氮除磷效率的影响

图4 发酵液pH值对菌剂脱氮除磷率的影响Fig.4Effects of pH value of fermentation broth on nitrogen and phosphorus removal rate

2.2 NG4干粉菌剂稳定性分析

2.2.1 NG4干粉菌剂基本特性

NG4干粉菌剂具有良好的沉降性能和抗冲击负荷的能力。相比于常见絮状污泥，有一定强度，结构紧凑，微生物相多样，可缩短运行时间，降低处理成本，剩余污泥的产量也大大降低,为生活污水的生物脱氮除磷提供了新的路径和方法。采用平板计数法对NG4干粉菌剂的活菌数进行测定，有效活菌数为108 CFU/g左右。菌剂宜在常温避光条件下保存。NG4干粉菌剂如图5所示。

图5 NG4干粉菌剂Fig.5Bacterial powder of NG4

2.2.2 NG4干粉菌剂稳定性试验

相比于常见絮状污泥，NG4干粉菌剂的优势之一是保存时间较长。在温度为(25±5)℃条件下，探究制备成功的干粉菌剂的保存时长，并进行菌剂稳定性试验。图6为NG4干粉菌剂在不同贮存时间下的除磷脱氮效率。

图6 贮存时间对菌剂脱氮除磷率的影响Fig.6Effect of storage days of microbial agentst on nitrogen and phosphorus removal rate

3 结 论

(1)NG4干粉菌剂的最佳工艺制备条件为：PAM培养液为2 mL，载体配比为m(麦麸)∶m(玉米粉)=85∶15，投菌量、发酵液投加量为20 mL，pH值为6.5。按照最佳工艺制备的NG4干粉菌剂除磷率为87.92%，脱氮率为90.29%。

(2)制备完成的NG4干粉菌剂有效活菌数为108 CFU/g左右。在温度为(25±5)℃条件下可保存40d左右。

(3)在最佳配比下制得NG4干粉菌剂，污染物去除率高且稳定性强。