黔芝2号的栽培配方筛选

张钦语,韦春某,张邦喜,杨仁德,陈 旭,陈 波,王晓敏,朱森林

(1.贵州省农业资源与环境研究所，贵州 贵阳 550006；2.国家菌草工程技术研究中心贵州分中心，贵州 贵阳 550006；3.贵州省菌草综合开发利用技术工程中心，贵州 贵阳 550006)

灵芝是一种典型药用菌，中国自古以来就将其当作珍贵的中药材加以利用，在《神农本草经》中将其列为上品［1］。灵芝性温、味苦，现代医学研究表明，其含有多糖肽、三萜、灵芝酸、甾醇等有效成分［2-3］，具有提高人体免疫力、护肝、抗血栓、降血脂、治疗神经衰弱等多种功效［4-5］。2017年以来我国年产灵芝近20万t，年产灵芝孢子粉2万t［6］。近年来，灵芝主要以木屑袋料栽培，导致“菌林矛盾”问题日益突出，砍伐树木，造成环境破坏。以菌草代替木屑栽培灵芝，能很好地解决“菌林矛盾”问题，菌草代料栽培的优势在于菌草机制成本低、来源广泛、生物量积累大，栽培料（菌草）来源便利和保护环境等优点［7-8］。菌草不仅能够充分满足灵芝栽培的营养条件，而且与木屑栽培没有明显的产量差异，同时还能够获得高品质的灵芝子实体。通过对纯木屑栽培料的改良，使用部分菌草替代木屑栽培料，能够有效缓解“菌林矛盾”。因此，设计不同的菌草替代木屑梯度进行灵芝栽培，通过对不同配方的灵芝菌丝和子实体观察，结合灵芝子实体活性成分如多糖、三萜类物质的分析，合理选择栽培灵芝适宜的菌草替代量，以期为菌草替代木屑种植灵芝提供科学参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试菌株 黔芝2 号，是灵芝品种中抗逆性强，多糖、三萜和甾醇类物质含量较高的品种之一，利于进行栽培基质优化试验。由贵州省农作物品种资源研究所提供。

1.1.2 试验试剂 PDA 培养基，购自索莱宝；苯酚、浓硫酸、葡萄糖、无水乙醇、碳酸氢钠、盐酸、乙酸乙酯、齐墩果酸均为分析纯，购自贵州爱瑞特生物科技有限公司。

1.1.3 仪器设备 电子分析天平，渡扬精密仪器（上海）有限公司；灭菌锅，上海深谙医疗器械厂；水浴锅，天津泰斯特仪器有限公司；离心机，贝克曼库尔特公司；旋转蒸发器，上海亚荣生化仪器有限公司；pH 计和紫外分光光度计，上海元析仪器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 试验设计 设置7 个菌草替代木屑用量梯度，栽培配方其他辅料不变，混合配制组成不同比例的栽培基质配方。以完全木屑栽培基质为CK，具体配方见表1。

表1 菌草代料栽培配方 %

1.2.2 栽培准备 选择在PDA 平板上菌丝生长健壮的黔芝2 号菌株，挑取0.5 cm 长的菌块接入500 mL 的PDA 液体培养基中，25℃静置培养24 h 后在25℃下振荡培养（120 r/min）7 d。不同配方处理分别进行栽培袋的拌料、装袋、灭菌等工序，使用规格为18 cm ×38 cm × 0.05 cm 的聚丙烯塑料袋，每袋装湿料1 100 g。每个配方设置20 个栽培袋，共计使用160个栽培袋。装袋完成后在121℃下灭菌2 h。待栽培袋冷却至30℃以下，在超净工作台中用液体母种接种栽培袋，每袋50 mL。菌丝发菌室温保持在22～30℃，空气湿度在60%左右，定时通风，避光培养。在菌丝长满袋后，菌袋表面菌丝体从白色转为浅黄色或褐色膜，及时开出芝孔，保持培养室湿度在80%～90%，温度控制在20～30℃，适度见光，定期通风透气。

1.2.3 不同代料栽培基质配方下灵芝子实体比较 发菌完成后，在2～3 个月内灵芝子实体完全成熟。不同的菌草栽培基质配方的出菇情况不同，子实体的产量和农艺性状也不同。在8 种不同配方中，每个配方10 袋栽培袋中随机选取5袋记录满袋时间（即菌丝长满栽培基质的所需要的时间）、芝蕾形成时间、菌盖长度、菌盖宽度。同时分别计算不同配方的出芝产量和生物转化率。

1.3 指标测定

将每个配方收集到的灵芝子实体分别粉碎为灵芝子实体粉末，精密称取1.00 g，参照NY/T 1676—2008 食用菌中粗多糖含量的测定标准，采用硫酸苯酚法，以葡萄糖做标准曲线测定灵芝子实体多糖含量。

将每个配方收集到的灵芝子实体分别粉碎为灵芝子实体粉末，取100 g 灵芝子实体粉末加入500 mL 乙醇溶液进行回流提取，合并提取液后，减压浓缩至原体积的1/5，用碳酸氢钠饱和溶液萃取2 次，在0℃条件下用6 mol/L 盐酸酸化至pH 3～4，见有沉淀析出后，用乙酸乙酯再提取沉淀，提取液减压浓缩后用乙醇溶解备用。参照王杉等［9］的灵芝三萜类物质的测定方法对所采收的灵芝子实体中三萜类物质的含量进行测定。

1.2.4 数据处理 试验数据使用Origin 2018 进行绘图，SPSS 16.0 中Duncan 法进行方差（P<0.05）分析。

2 结果与分析

2.1 不同配方的灵芝农艺性状和产量

由表2可知，所有配方的栽培基质都能够顺利出芝，不同配方的子实体具有显著差异，随着菌草替代木屑量的增加，灵芝菌丝的满袋时间没有明显变化，均为63～65 d。在满袋后对菌丝进行观察发现菌草替代量增加，CK 的菌丝生长密度最为浓密，随着菌草添加量增加，菌丝的生长密度逐渐稀疏，但各配方形成芝蕾的时间并无明显差异，为70～72 d。表明菌草的添加量不影响芝蕾的形成时间。配方3 的子实体菌盖长度最长，为10.57 cm；宽度最宽，为10.38 cm；较CK 分别高1.14%、1.35%。不同配方的生物转化率为8.48%～13.65%，其中，配方3 为13.65%，CK 为12.84%，较配方3 低0.81%，且当菌草的添加量大于30%后，灵芝的生物转化率越小，对灵芝出芝的影响越大。配方3的袋均产量最高，为52.08 g，比CK 高1.8%；配方1和配方2 的袋均产量分别为49.35 g 和49.81 g，较CK 分别下降3.54%和3.64%；当菌草的添加量超过配方3后，袋均产量逐渐下降；当添加量达70%时（配方7），袋均产量仅有37.58 g，与30% 添加量相比下降了27.8%，表明当菌草的添加量超过30%后，将对灵芝产量造成严重影响。结果与王凯等［10］研究结果一致。

表2 不同栽培基质的灵芝子实体部分农艺性状及产量

2.2 不同配方的灵芝多糖含量

由图1可知，配方3 的多糖含量显著高于其他配方，在配方3 的栽培基质下，灵芝的多糖含量达9.26 mg/g，比CK 的多糖含量（5.64 mg/g）高64.18%；配方4 略低，为7.78 mg/g，比CK 高37.94%。但巨菌草的添加量在除配方3 和配方4 外与CK 的多糖含量差异不大。表明当巨菌草替代30%～40%的木屑用量时，可显著增加灵芝的子实体的多糖含量，提升灵芝品质，获得更高的活性多糖物质。

图1 不同栽培配方灵芝子实体的多糖含量

2.3 不同配方的灵芝三萜类物质含量

由图2可知，在CK 的栽培基质下灵芝子实体得到的三萜类物质含量仅为1.24 mg/g；配方3 的含量最高，为2.26 mg/g，比CK 高82.3%；配方1、配方2 和配方4 都分别比CK高22.6%、50%和30.6%，表明当巨菌草替代木屑用量10%～40%时，有助于灵芝子实体三萜类物质的产生，相比于CK 的纯木屑栽培，菌草适当替代木屑能够使栽培的灵芝子实体在生长过程中积累更多的三萜类物质。

图2 不同栽培配方灵芝子实体的三萜含量

3 结论

研究表明，配方3（巨菌草30%、木屑48%、麸皮20%、石膏1%、蔗糖1%）最适宜栽培黔芝2 号，与CK 配方（巨菌草0%、木屑78%、麸皮20%、石膏1%、蔗糖1%）相比，菌丝生长相对稀疏，满袋时间和芝蕾形成时间无差异。配方3 的子实体菌盖长度最长，为10.57 cm；宽度最宽，为10.38 cm；比CK 配方分别高1.14%、1.35%。相比于其他配方，配方3 所获的袋均产量最高，为52.08 g，比CK 配方高1.8%，其余配方的袋均产量均低于CK 配方。且配方3 栽培获的灵芝子实体活性物质多糖和三萜含量分别达9.26 mg/g、2.26 mg/g，比CK 配方分别高64.18%、82.3%，配方4 的多糖含量仅次于配方3，为8.01 g/mg。因此，配方3（巨菌草30%、木屑48%、麸皮20%、石膏1%、蔗糖1%）适合用于黔芝2号的菌草代料栽培。