丁酸钙对蛋鸡脂质代谢及其相关基因表达的影响

刘洋,周振雷

(南京农业大学动物医学院,江苏 南京 210095)

脂质是人和动物的重要营养素之一,为机体提供能量和必需脂肪酸。与哺乳动物脂肪组织作为脂质代谢的主要部位不同,肝脏是禽类脂肪代谢的主要器官,而脂肪组织主要用于脂肪酸的储存[1-2]。肝脏通过分解胆固醇产生胆汁酸,有助于脂质消化吸收[3]。对蛋鸡来说,鸡蛋内的脂类物质主要由机体自身内源性合成,产蛋时脂质代谢途径频繁周转,肝脏脂肪生成提高[4-5]。随着日龄的增长,经密集产蛋后肝脏脂质代谢紊乱,易导致脂肪在肝脏中过度沉积,从而影响家禽的健康和生产性能[6-7]。例如笼养蛋鸡肝脏脂质的沉积是脂肪肝出血综合征的诱因,导致产蛋率急剧下降,蛋鸡死亡率升高[8]。此外,腹部脂肪的沉积与饲料效率呈负相关[9]。因此,调节蛋鸡脂质代谢有利于提高蛋鸡养殖经济效益和改善动物福利。

丁酸是后肠微生物发酵膳食纤维产生的一种四碳短链脂肪酸,通过影响肠道及邻近组织发挥作用。作为一种安全的饲料添加剂,丁酸具有调节动物能量代谢,改善肠道健康,提高免疫力,改善动物的生产性能和健康的功能,已经在畜禽生产中应用了几十年。在蛋鸡日粮中添加丁酸或其盐还可提高蛋鸡的产蛋率和营养物质的吸收与利用,改善蛋品质[10-12]。与此同时,丁酸在脂质代谢的调控中有较好的应用前景。有研究表明,日粮中添加丁酸钠能提高肉仔鸡屠宰率,降低腹部脂肪含量[13]。此外,已有研究表明,禁食后复喂丁酸钠可降低脂肪合成相关基因的表达,降低肝脏甘油三酯的含量[14]。然而,关于丁酸对蛋鸡脂质代谢的调控尚缺乏系统的研究与报道。丁酸钙是丁酸的钙盐,有报道称丁酸钙可以提高肉仔鸡脂质与蛋白质的消化率[15],但目前尚无丁酸钙对蛋鸡脂质代谢影响的研究报道。因此,本研究旨在研究基础日粮中添加丁酸钙对蛋鸡脂质沉积的影响并探讨其机制,为其生产应用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

丁酸钙(纯度90%)购于广州英赛特生物技术有限公司;4%多聚甲醛、无水乙醇、二甲苯、苏木精伊红(HE)染色液购于南京农业大学实验材料供应中心;TRIzol试剂购于南京奥青生物技术有限公司;反转录试剂盒、qPCR试剂盒购于南京诺唯赞生物科技股份有限公司。

1.2 试验设计与饲养管理

试验选取480只42周龄的海兰褐蛋鸡,随机分为4组,分别在基础日粮(表1)中添加0、500、1 000和1 500 mg·kg-1的丁酸钙。预饲期1周,试验期为8周。每组8个重复,每个重复15只蛋鸡(每笼5只)。每日光照16 h。所有蛋鸡自由采食和饮水。

表1 基础日粮组成及营养水平Table 1 Ingredient composition and nutrient contents of basal diet

1.3 样品采集

在第8周末,每个重复随机选取体重相近的一只鸡称重,翅静脉采血后通过颈椎脱位处死。分离肝脏和腹部脂肪并称重,以计算与体重的比值,分别称为肝脏指数和腹脂率。采集同一部位的肝脏,生理盐水冲洗后,一部分组织置于4%的多聚甲醛中,另一部分组织用液氮速冻后-80 ℃保存。

1.4 检测指标和方法

1.4.1 血清生化指标检测血清中甘油三酯(triglyceride,TG)、总胆固醇(total cholesterol,TC)、高密度脂蛋白胆固醇(high density lipoprotein cholesterol,HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(low density lipoprotein cholesterol,LDL-C)采用自动生化分析仪(BX-4000,Sysmex)检测。

1.4.2 组织内TC、TG含量的测定准确称量肝脏和蛋黄组织30 mg,加入270 μL无水乙醇进行匀浆,2 500 r·min-1离心10 min,取上清液用比色法测定蛋黄TC和肝脏TC、TG的含量。

1.4.3 肝脏形态结构将固定的组织进行石蜡包埋,将包埋蜡块切成5 μm厚切片,苏木精伊红(HE)染色后,倒置显微镜(CKX53,Olympus,日本)下观察并拍照。

1.4.4 肝脏RNA提取和Real-time PCR使用Trizol试剂按照说明书提取肝脏总RNA。用NanoDrop 2000分光光度计在D260/D280处测定RNA浓度,并将所有样品稀释至500 ng·μL-1,按照反转录试剂盒说明书合成cDNA。使用SYBR qPCR Master Mix试剂盒在ABI PRISM 7300 HT序列检测系统进行实时荧光定量PCR。目的基因的引物序列如表2所示。以GAPDH作为内参基因,采用2-ΔΔCT计算基因mRNA的相对表达量。

表2 荧光定量PCR的引物序列Table 2 Sequence used for real-time PCR

1.5 数据分析与统计

所有数据均采用SPSS 26.0软件进行单因素方差分析(one-way ANOVA),各组间差异用Tukey法进行多重比较。结果以平均值±标准误表示。

2 结果与分析

2.1 丁酸钙对蛋鸡肝脏指数和腹脂率的影响

从图1可见:与对照组相比,基础日粮中分别添加500和1 000 mg·kg-1丁酸钙的蛋鸡肝脏指数显著降低(P<0.05),1 000和1 500 mg·kg-1丁酸钙处理的蛋鸡腹脂率显著低于对照组(P<0.05)。

图1 丁酸钙对蛋鸡肝脏指数和腹脂率的影响Fig.1 Effects of calcium butyrate on liver index and abdominal fat percentage of laying hens各组间不同字母表示差异显著(P<0.05)。下同。Different letters indicate significant differences among groups(P<0.05). The same below.

2.2 丁酸钙对蛋鸡血清脂质含量的影响

如表3所示:添加1 500 mg·kg-1丁酸钙有降低TC、TG、HDL-C、LDL-C含量的趋势,但与对照组相比均无显著性差异(P>0.05)。

表3 丁酸钙对蛋鸡血清脂质含量的影响Table 3 Effects of calcium butyrate on serum lipid content of laying hens

2.3 丁酸钙对蛋鸡肝脏和蛋黄脂质含量的影响

如图2所示:与对照组相比,添加500 mg·kg-1丁酸钙显著降低肝脏TG的含量(P<0.05)。添加500和1 000 mg·kg-1丁酸钙的蛋鸡蛋黄的TC含量显著低于对照组(P<0.05),而添加丁酸钙对肝脏TC含量无显著影响(P>0.05)。

图2 丁酸钙对蛋鸡肝脏和蛋黄甘油三酯(TG)和胆固醇(TC)含量的影响Fig.2 Effects of calcium butyrate on triglyceride(TG)and cholesterol(TC)contents in liver and yolk of laying hens

2.4 丁酸钙对蛋鸡肝脏组织形态的影响

如图3所示:对照组肝细胞内有大小不一的脂滴(箭头所示),添加丁酸钙后脂滴的沉积明显减少。

图3 丁酸钙对蛋鸡肝脏组织形态的影响Fig.3 Effects of calcium butyrate on liver histomorphology of laying hens

图4 丁酸钙对蛋鸡脂质合成(A)、分解与利用(B)相关基因表达量的影响Fig.4 Effects of calcium butyrate on expression levels of genes related to lipid synthesis(A) and lipid decomposition and utilization(B)of laying hens

2.5 丁酸钙对蛋鸡脂代谢相关基因表达量的影响

如图4所示:与对照组相比,添加1 000和1 500 mg·kg-1丁酸钙蛋鸡的SREBP-1c和ACCmRNA表达量显著降低(P<0.05),添加500 mg·kg-1丁酸钙蛋鸡的ACCmRNA表达量显著升高(P<0.05)。与对照组相比,添加500和1 500 mg·kg-1丁酸钙蛋鸡的CPT1αmRNA表达量显著升高(P<0.05)。添加不同浓度丁酸钙蛋鸡的CYP8B1mRNA表达量显著低于对照组(P<0.05)。

3 讨论

丁酸作为一种酸化剂可以降低胃肠道内的酸碱度,提高产蛋后期蛋鸡乳杆菌、双歧杆菌等有益菌的数量,降低沙门氏菌、大肠杆菌等有害菌的数量,增加肠道绒毛高度与隐窝深度的比值,改善消化酶活性[10,16]。此外丁酸还能提高蛋鸡的产蛋率、蛋质量和饲料转化率,促进肠道营养转运蛋白的表达,降低饲料成本,提高生产利润[12,17]。目前有关丁酸对蛋鸡脂质代谢影响的研究较少。

蛋鸡腹部脂肪的过度沉积影响蛋鸡的生产性能[18]。本研究结果显示,随着日粮中丁酸钙添加量的增加,腹脂率呈剂量依赖性下降,表明饲喂丁酸钙可降低蛋鸡脂肪沉积。这与之前肉仔鸡的研究结果一致[19]。肝脏是家禽脂质代谢(如脂质合成、分解和转运)的主要器官。日粮中添加0.1%丁酸钠可以使21日龄肉鸡的肝脏指数降低[20],本研究结果与之相似,添加500或1 000 mg·kg-1丁酸钙蛋鸡的肝脏指数均降低。产蛋可促进肝脏合成脂肪,TG作为能量的供体[21],其在肝脏中的积累程度是脂质代谢紊乱的指标。先前有研究发现丁酸钠可降低高脂日粮小鼠肝脏的TG水平[22],也有研究表明包被丁酸钠可降低蛋鸡血清中TG水平[10],本研究结果表明饲喂500 mg·kg-1丁酸钙可降低肝脏TG含量,但血清脂质含量没有发生显著变化。添加丁酸钙还缓解了肝脏中的脂滴沉积。以上结果表明添加丁酸钙可能通过降低蛋鸡肝脏脂质沉积,改善脂质代谢紊乱的状况。

鸡蛋富含多种营养素,但其高胆固醇含量导致的健康问题已引起社会的广泛关注[23]。最近有研究表明有机酸和丝兰提取物能降低血清和蛋黄胆固醇水平[24],本研究结果与之相似,日粮中添加500或1 000 mg·kg-1丁酸钙蛋黄的胆固醇含量均降低,这可能与胆固醇吸收与合成减少、粪便胆固醇排泄增加有关。

为了进一步揭示丁酸钙降脂作用的机制,本研究检测了脂质代谢关键基因的表达。ACC是第1个脂肪酸合成过程中的限速酶,FAS位于胞质中,能催化脂肪酸碳链伸长,在脂肪生成过程中起到重要作用[25-26]。SREBP-1c是调节脂肪酸代谢的重要转录因子,可激活FAS和ACC调控脂肪酸生成[27-28]。PPARγ是脂肪细胞分化和生成的关键调控因子,调控成脂基因的表达[21]。在本研究中,日粮添加1 000或1 500 mg·kg-1丁酸钙蛋鸡肝脏的ACC和SREBP-1cmRNA表达量降低,可能导致脂肪酸合成能力的减弱。这与之前的研究类似,其机制可能是丁酸钙通过激活AMP依赖的蛋白激酶(adenosine 5′-monophosphate-activated protein kinase,AMPK)调控这些基因的表达来抑制脂质生成[14,29]。本研究中,各组肝脏FAS和PPARγmRNA表达无显著差异,而有研究表明,日粮中添加丁酸钠可提高仙居鸡肝脏中PPARγ的表达[30],结果不一致的原因可能与添加丁酸的种类和剂量不同有关。CPT1和ACOX是脂肪酸β氧化中的限速酶[31]。FXR是胆汁酸的受体,在调节肠肝循环和脂质代谢中发挥重要的作用[32]。本研究中,日粮中添加500或1 500 mg·kg-1丁酸钙均上调了CPT1αmRNA的表达,说明蛋鸡脂肪酸分解能力可能增强,这与之前在断奶仔猪上的研究结果相似[33]。在本研究中,各组间肝脏FXR和ACOXmRNA表达无显著差异,提示丁酸钙并非通过FXR-ACOX途径调控脂质分解。CYP7A1是胆汁酸合成过程中经典途径的第1个限速酶,主要生成胆酸和鹅去氧胆酸,而CYP8B1调控胆酸和鹅去氧胆酸的比值[34-35]。有趣的是,添加丁酸钙组肝脏CYP8B1mRNA的表达量降低,提示胆固醇分解能力减弱,原因可能为肠道中的胆固醇吸收减少或排泄增加维持了胆固醇的动态平衡[36]。

综上,日粮中添加丁酸钙减少肝脏、蛋黄和腹部脂肪沉积,这可能与丁酸钙上调肝脏CPT1αmRNA的表达,下调肝脏SREBP-1c、ACC和CYP8B1mRNA的表达有关,其中1 000 mg·kg-1丁酸钙添加效果最佳。