丛枝菌根真菌对盐渍土辣椒生长、生理代谢及土壤无机磷组分的影响

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验于2020年7—9月在河南农业职业学院园艺大棚中进行。供试辣椒品种为艳红323F3，种子来自河南省农业科学院园艺研究所。

AMF接种菌剂由摩西斗管囊霉()、幼套近明球囊霉()及明根孢囊霉()混合而成，这3种菌株均购自北京农林科学院植物营养与资源研究所。

试验地土壤类型为中壤土，0～20 cm土层土壤理化性质：pH值为7.64，全氮含量为1.11 g/kg，碱解氮含量为64.7 mg/kg，有效磷含量为21.42 mg/kg，速效钾含量为124.16 mg/kg，电导率为216.52 μS/cm，Na含量为5.5 mg/kg，为中等土壤盐水平。

1.2 试验设计

试验设置单因素5水平完全随机试验设计，因素为施用丛枝菌根真菌菌剂(AM)，水平分别为0、20、40、60、80 g/kg，分别记为CK、AM20、AM40、AM60、AM80。每个处理重复3次。

盆栽装置为聚乙烯塑料桶，盆高20 cm，上口径15 cm，底径13 cm。每盆装土3 kg，按各处理的AMF施用量将菌剂与土壤混合均匀。将种子在5%双氧水中浸泡2～3 min，表面消毒3次，再用无菌蒸馏水清洗数次，每盆施用种子9粒，发芽7 d后间苗至3株。辣椒株距40 cm，此后，每2周向盆钵中加入50 mL 0.5 mol/L Hoagland’s营养液且不定时适量加水，试验其他管理措施同辣椒生产操作规程，培养50 d。

1.3 样品采集及测定分析

1.3.1 辣椒生物量及根系AMF侵染率、植株生物量、磷含量及农艺性状测定培养结束后，将根系切成 1 cm 长的小段，采用品红溶液染色，光学显微镜下用网格交叉记数法计算AMF侵染率，具体方法参照Phillips描述的方法。

收获全部盆栽中的植物，将辣椒地上部、根系分离，置于烘箱中杀青30 min，70 ℃烘干至恒质量并称量记录。农艺性状包括株高、叶片指数，测量方法同常规农作物农艺性状测量。每个处理重复3次。干物质测定完毕后，将植株粉碎处理，采用HSO-HO消化后采用钒钼黄比色法测定植株磷含量。

1.3.2 辣椒光合色素、抗氧化物质含量测定可溶性糖含量采用蒽酮比色法测定，可溶性蛋白含量采用苯酚-硫酸法测定，丙二醛(MDA)含量采用硫代巴比妥酸比色法测定，光合色素包含叶绿素a、叶绿素b，两者皆采用丙酮-乙醇混合浸提法测定，具体步骤参照高俊凤的方法。

1.3.3 土壤磷形态含量测定培养结束后，从每个处理的3次重复中收集根际土壤样品。使用铁锹将包含根系的辣椒植株挖出，去除距离根系过远的土壤，从根部附近(0.5～2.0 cm)收集非根际土壤。为了收集根际部分，将整个植物从土壤中取出并轻轻摇动摆脱松散的土壤，接着进一步加重摇动以分离附着的根际土壤。根际土壤通过0.15 mm网筛采用NaOH熔融后钼锑抗比色法进行全磷测定。通过2 mm网筛进行其他磷形态分析，有效磷(A-P)、闭蓄态磷(O-P)、无机形态磷(Fe-P、Al-P、Ca-P、Ca-P、Ca-P)含量的测定参考蔡鑫淋等的方法进行。

1.3.4 辣椒氧化酶相关基因及磷吸收基因表达水平测定根据目前GenBank序列数据库公布的辣椒(L.)转录组序列信息得到抗氧化酶相关的酶基因(-、、)。根据以上基因的序列借助Primer Express 5.0软件设计扩增引物(表1)。根据Tan等报道的AMF介导的主要磷吸收基因，看家基因为，使用SYBR Green Real-time PCR Master Mix(Toyobo，Osaka，Japan)和Bio-Rad CFX96实时检测系统进行定量PCR检测。相关的RNA抽提和cDNA扩增、检测及反应体系参照董桑婕的方法。相对表达水平采用2-ΔΔ算法进行计算。

表1 qRT-PCR 引物序列信息

1.4 数据处理与统计分析

采用Microsoft Excel 2016进行数据整理，采用DPS 14.0软件进行单因素方差分析(=0.05)，采用Origin 9.1软件进行图形绘制。

2 结果与分析

2.1 施入丛枝菌根真菌对辣椒侵染的影响

由图1-A可知，未接种AMF处理无侵染情况，在接种处理中(AM20、AM40、AM60、AM80)菌根侵染率为49.73%～68.55%，各处理表现为AM80>AM60>AM40>AM20，且与AM20处理相比，AM40、AM60、AM80处理分别增加8.15、16.63、18.82百分点，其中AM60、AM80处理显著大于AM20处理。由图1-B可知，对AMF施用量与侵染率进行线性相关分析发现，二者呈显著正相关关系(=0.975、<0.05)，即随着AMF施用量增加，侵染率随之提高。

2.2 施入丛枝菌根真菌对辣椒生长参数的影响

由表2可知，干物质累积量中，以AM处理(AM20、AM40、AM60、AM80)较高，但AM处理间皆无显著差异；与CK处理相比，AM20、AM40、AM60、AM80处理的干物质分别显著提高31.88%、65.27%、34.01%、26.38%。农艺性状中，各处理株高表现为AM40>AM20>AM80>AM60>CK，其中AM20、AM40处理无显著差异，且两者皆显著大于其他处理；叶面积仍以CK处理最低，接种AMF的处理较其增加16.97%～65.36%，其中AM40、AM60处理显著大于CK处理；茎粗中，处理间差距较小，两两处理间皆未达显著差异水平。

表2 施入丛枝菌根真菌对辣椒农艺性状及叶绿素含量的影响

就叶绿素含量而言，叶绿素a含量以高AMF施用量处理(AM40、AM60、AM80)较高，三者间无显著差异，且AM40处理显著大于CK、AM20处理。各处理叶绿素b含量以AM60处理最高，为0.89 mg/g，AM40、AM80处理其次(0.86 mg/g)，三者间无显著差异，且皆显著大于CK、AM20处理。叶绿素a+b含量仍以CK处理最低，各处理表现为AM40>AM60>AM80>AM20>CK，与CK处理相比，接种AMF处理的叶绿素a+b含量显著提高3.94%～15.75%，且AM40、AM60、AM80处理均显著大于AM20处理。

2.3 施入丛枝菌根真菌对辣椒抗氧化系统参数的影响

由图2-A可知，丙二醛含量中，以CK处理最高，AM处理(AM20、AM40、AM60、AM80)分别较其显著降低50.6%、56.02%、52.22%、36.76%，其中AM80处理显著大于其他AM处理。由图2-B可知，可溶性糖含量以CK处理最低，显著低于其他处理，以AM60处理最高，AM80处理其次，二者无显著差异，且皆显著高于CK、AM20处理。可溶性蛋白含量中各处理顺序表现为AM60>CK>AM40>AM20>AM80，但处理间皆无显著差异(图2-C)。

抗氧化酶相关基因中，超氧化歧化酶基因(-)以AM20处理表达水平最高，但AM处理间均无显著差异，且与CK处理相比，AM处理显著提高100.12%～183.52%(图2-D)。过氧化氢酶基因()相对表达丰度则以AM40处理最高，为4.85，其他处理较其显著降低51.34%～80.21%，此外AM60处理显著大于AM20和CK处理(图2-E)。过氧化物酶基因()的表达水平，各处理表现为AM60>AM40>AM20>AM80>CK，且与CK处理相比，AM20、AM40、AM60、AM80处理分别显著提高234.51%、280.99%、535.21%、172.54%，其中AM60处理显著大于其他AM处理(图2-F)。

2.4 施入丛枝菌根真菌对辣椒土壤磷组分及总磷含量的影响

根际土壤无机磷组分分为有效磷(A-P)、钙态磷(Ca-P、Ca-P、Ca-P)、铁磷(Fe-P)、铝磷(Al-P)、闭蓄态磷(O-P)和总磷(TP)。由图3-A可知，就磷组分含量来看，钙磷(Ca-P、Ca-P、Ca-P)是盐渍土壤中的主要P组分，其组分含量占总组分的54.89%，各组分含量表现为Ca-P>O-P>Ca-P>Ca-P>A-P>Al-P>Fe-P，表明Ca-P是土壤中的主要磷组分。就处理来看，不同处理在不同磷组分中的规律不尽一致。整体而言，与CK处理相比，AM处理(AM20、AM40、AM60、AM80)整体提高了Al-P、Fe-P、A-P、Ca-P、Ca-P的含量，其增幅分别为33.14%～56.34%、7.67%～35.92%、38.26%～75.84%、4.77%～44.39%、4.51%～36.22%，但在 Ca-P、Ca-P中的效果不明显；此外，试验数据表明，与CK处理相比，AM处理降低了O-P和 Ca-P的含量，其降幅分别为13.79%～25.59%、3.38%～9.17%。从土壤全磷含量来看，各处理表现为AM80>AM60>AM40>AM20>CK，但处理间均无显著差异(图3-B)。

2.5 施入丛枝菌根真菌对辣椒磷吸收量及相关基因表达的影响

由图4-A可知，各处理辣椒植株磷含量表现为AM40>AM20>AM60>AM80>CK，其中AM40、AM20处理二者间无显著差异，其他处理较AM40、AM20处理分别显著降低10.02%～17.88%、13.03%～20.63%；以CK、AM80处理最低，二者无显著差异且分别比AM60处理显著降低8.74%、7.14%。在磷吸收基因中，CK处理的相对表达丰度为1.13，AM处理下该基因的表达水平显著增加377～1 787倍，其中AM40处理的表达水平最高，显著大于其他处理，AM20处理其次，其大于AM60、AM80处理，其中与AM80处理达显著差异水平。

2.6 施入丛枝菌根真菌条件下磷指标间的相关性分析

从辣椒植株磷指标及土壤磷指标间的相关性分析结果(表3)可知，Ca-P含量与土壤全磷、O-P含量呈极显著负相关；O-P含量与Ca-P、Fe-P、Al-P、A-P含量及表达水平均呈显著负相关；Fe-P含量与Al-P含量、表达水平与植株磷含量均呈极显著正相关；表达水平与Ca-P、Al-P、A-P含量，植物磷含量与Ca-P、A-P 含量，A-P含量与Ca-P、Ca-P含量均呈显著正相关。

表3 施入丛枝菌根真菌条件下磷指标间的相关性分析结果

3 讨论与结论

土壤盐碱胁迫可通过抑制一系列生理生化代谢从而限制植物的生长发育，同时，植物也已经进化出一系列防御机制来适应环境胁迫，这涉及酶促反应和渗透物质。较长时间的盐胁迫会诱导活性氧的过量产生，从而导致脂质、DNA、RNA和蛋白质过氧化，最终导致细胞死亡，接种AMF有助于减缓由过氧化对植物细胞造成的损害。本研究结果表明，在盐渍土中施用AMF菌剂使辣椒幼苗的超氧化歧化酶基因(-)、过氧化氢酶基因()和过氧化物酶基因()表达水平发生明显上调，且增加了可溶性糖含量，减少了MDA的积累。前人研究表明，AMF可以通过调节酶基因(如、)和非酶促基因(如、)来消除活性氧。其他研究表明，接种AMF可以提高胁迫条件下核桃幼苗中渗透物质的水平，有助于减缓环境胁迫造成的损伤。然而，对于辣椒植株，这种作用体现在可溶性糖含量上，但在可溶性蛋白含量上不明显。这表明，在施用AMF后，渗透物质调节不是增强辣椒幼苗耐盐性的主要途径。

普遍认为，与土壤微生物构建有益的共生关系是陆生植物应对非生物胁迫的较佳策略之一，然而微生物与植物在相互促进的本质是物质交换，因此共生关系随着环境条件变化以及植物生长、衰老和死亡而发生变化。本研究中，施用不同用量的丛枝菌根真菌均在辣椒幼苗根系上表现出较高的侵染率(49.73%～68.55%)，线性相关分析结果表明，AMF施用量与侵染率呈显著正相关，即AM80处理侵染率最高。然而在干物质、农艺性状及叶绿素含量等生长参数中，AM80处理没有表现出最好的促进效果，这表明侵染率与辣椒植株长势之间没有明显的趋同性。就试验数据来看，AM40处理在干物质量、株高、茎粗及叶绿素总量中具有最大值，同时明显高于AM80处理。这可能是因为较高密度地接种AMF可能会降低或不平衡关键植物激素的浓度，此外，菌根共生的主要驱动因素是植物光合碳产物与菌丝矿质养分的交换，较大的AMF群体也意味着植物需供给较多的碳产物，因而多方面影响着宿主植株的生长。

土壤P素是植物生长发育所需的重要矿质元素，土壤P组分及其含量是决定土壤P供给水平的关键。本研究结果表明，钙磷(Ca-P、Ca-P、Ca-P)是盐渍土壤中的主要P组分；研究结果进一步表明，与CK处理相比，AM处理(AM20、AM40、AM60、AM80)整体提高了Al-P、Fe-P、A-P、Ca-P、Ca-P含量，降低了O-P和Ca-P含量。此外，在本研究中，磷基因()和磷吸收量在施用AMF菌剂后整体提高，且峰值皆出现在AM40处理。本研究中，相关性分析结果表明，A-P含量与Ca-P、Ca-P含量呈正相关，Fe-P含量与Al-P含量呈正相关，O-P含量显示与Ca-P、Fe-P和Al-P含量呈负相关，表达水平与Ca-P、Al-P、A-P含量，植物磷含量与Ca-P、A-P含量，A-P含量与Ca-P、Ca-P含量均呈显著正相关。这表明施用AMF菌剂可以将不溶和难溶性P(O-P、Ca-P)活化为可用P(A-P、Ca-P、Ca-P)和缓速P(Fe-P、Al-P)，从而为植株P吸收提供来源。可能原因有：(1)AMF可以形成一个致密的菌丝网络，影响植物间的养分流动，且磷酸盐离子在菌丝内扩散速度比在根毛中更快，加速磷在土壤中的扩散；(2)AMF可影响呼吸或有机酸(如草酸、柠檬酸等)分泌过程中的H分泌将不溶或难溶性P转化为可溶性P形态；(3)AMF能够诱导P转运蛋白基因的表达，使寄主植物产生更多的磷转运蛋白。

目前，AMF的接种量没有统一的标准，确定接种量的一些常用方法是由接种潜力、单位体积的孢子密度或接种物的质量决定的。然而，在实际的大规模农业实践中，AMF是在培养后使用的，不仅含有孢子，还含有菌丝、囊泡、菌根段等繁殖体，在接种时应加以考虑。本研究中，选择传统的孢子含量作为菌剂的施用指标，整体而言，40 g/kg 的施用量对混合菌剂的定殖率、辣椒幼苗生长和磷吸收与活化取得了最佳效果。这些结果为AMF菌剂在田间的应用提供了理论基础。